肿瘤干细胞样细胞在上皮性卵巢癌血管生成拟态中作用的研究

发布时间：2018-06-20 23:49

本文选题：上皮性卵巢癌 + 肿瘤干细胞　；参考：《河北医科大学》2016年博士论文

【摘要】：目的:上皮性卵巢癌(Epithelia ovarian cancer,以下简称卵巢癌)是严重威胁广大妇女健康的妇科恶性肿瘤之一。由于该疾病早期临床症状不明显,多数患者发现时已处晚期。虽然经过规范的肿瘤细胞减灭术以及术后辅以铂类为主的药物联合化疗能够改善患者预后,但是由于其较易发生侵袭转移和肿瘤复发,严重影响患者的生活质量。因此,对卵巢癌的发病、复发以及耐药机制做深入的研究已成为妇科恶性肿瘤研究领域的难点与热点问题。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是一类可复制或者再生的肿瘤细胞,数量较少,具有无限增殖、自我更新、高致瘤性等特点,可成功地进行异种移植并呈现与原肿瘤相同的具有异质性的细胞表面标志物或表型。CSCs在肿瘤的发生、侵袭转移以及肿瘤复发、化疗耐药中起至关重要的作用。目前用于CSCs研究的的肿瘤干细胞标记分子有CD133、CD117、CD24、CD44和乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)等。因卵巢癌CSCs至今尚未分离鉴定,我们将此种具有CSCs生物学特性的卵巢癌细胞称之为肿瘤干细胞样细胞。血管生成拟态(Vasculogenic mimicry,VM)结构自发现至今已有10多年的历史。该结构由经过塑形的肿瘤细胞和能够被过碘酸雪夫氏试剂(Periodic acid Schiff,PAS)染色阳性的物质围成管道样结构,血液流淌其中,能够为肿瘤的生长提供营养。VM是肿瘤血液供应除血管外的另一重要结构。研究发现VM与众多恶性肿瘤预后密切相关。CSCs不仅参与血管的发生,还可能通过诸如信号转导通路使肿瘤干细胞的塑形、横向分化等,参与恶性肿瘤VM的形成,共同影响肿瘤的发生、侵袭以及转移。本研究第一部分收集术后随访资料完整的卵巢癌患者石蜡标本120例,采用CD31/过碘酸雪夫氏试剂(Periodic acid Schiff,PAS)双重染色法鉴定VM结构;采用免疫组织化学SP法检测CD133的表达。回顾性分析CD133、VM与卵巢癌患者临床病理资料的关系及二者对患者生存时间的影响。探讨cd133、vm在上皮性卵巢癌中的表达及其与临床病理特征和患者预后的关系。第二部分采用无血清悬浮培养法培养人卵巢癌skov3细胞,分离获得悬浮生长的细胞球,经过传代培养观察其生物学特性及此类细胞的形态学变化。采用流式细胞仪检测第1、3、5、7代分选细胞cd133阳性细胞比例,采用平板克隆形成实验和小鼠体内成瘤实验鉴定第7代分选细胞生物学特性;通过matrigel三维立体培养比较第7代分选细胞与亲代skov3细胞的vm形成能力,采用rt-pcr的方法,检测第7代分选细胞与亲代skov3细胞的vm形成关键因子基质金属蛋白酶2,9(matrixmetalloproteinases-2,9,mmp-2,mmp-9)含量的差异性,初步探讨卵巢癌干细胞样细胞在vm形成机制中的作用。第三部分将无血清悬浮培养的第7代分选细胞接种于裸鼠,建立卵巢癌移植瘤模型,分别给予顺铂(cisplatin,ddp)最大耐受剂量化疗(mtd-ddp)和低剂量节拍化疗(ldm-ddp)。采用cd31/pas双重染色法鉴定卵巢癌组织中vm的结构,显微镜下分别计数vm和微血管数量,比较其差异性。采用western-blot方法检测两种化疗方式裸鼠皮下移植瘤组织中vm信号通路上皮细胞激酶(epithelialcellkinase,epha2)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,pi3k)、层黏连蛋白-5γ2链(laminin-5γ2,ln-5γ2)表达的差异性。分析两种化疗方式对于裸鼠移植瘤模型vm及微血管形成的影响,初步探讨mtd-ddp与ldm-ddp对于vmepha2信号通路的影响,为卵巢癌的靶向治疗提供新的临床思路。第一部分肿瘤干细胞标志物cd133在上皮性卵巢癌血管生成拟态中的表达及意义方法:收集术后随访资料完整的上皮性卵巢癌患者石蜡标本120例,采用cd31/pas双重染色法鉴定卵巢癌组织中vm的结构;采用免疫组织化学sp法检测cd133的表达。回顾性分析cd133表达、vm形成与患者临床病理资料的关系,以及cd133表达和vm形成对患者生存时间的影响。结果:1120例上皮性卵巢癌患者的临床病理资料特点120例上皮性卵巢癌患者中,小于60岁的患者为78例(65.0%),大于等于60岁患者为42例(35.0%);按组织学分类分为浆液性癌74例(61.7%),黏液性癌35例(29.2%),子宫内膜样癌11例(9.1%);按照figo(2009年)手术-病理分期:i期28例(23.3%),Ⅱ期10例(8.3%),iii期60例(50.0%),iv期22例(18.4%);按照组织分化程度:高分化(g1)17例(14.2%),中分化(g2)59例(49.2%),低分化(g3)44例(36.6%);发生淋巴转移者为51例(42.5%),无淋巴转移者为69例(57.5%)。39例(32.5%)患者产生铂类耐药,81例(67.5%)患者为铂敏感患者。2上皮性卵巢癌组织中vm结构以及cd133的表达情况120例上皮性卵巢癌组织中,vm结构阳性(vm+)为52例,占总数的43.3%,vm阴性(vm-)68例,占总数的56.7%。cd133表达阳性(cd133+)56例,占总数的46.7%,阴性(cd133-)64例,占总数的53.3%。其中,cd133+vm+38例,占总数的31.7%,cd133-vm+14例,占总数的11.7%,cd133+vm-18例,占总数的15.0%,cd117-vm-50例,占总数的41.6%。3上皮性卵巢癌组织中vm形成、cd133的表达与患者临床病理资料的关系上皮性卵巢癌组织中vm的形成与患者的年龄、组织类型及淋巴结有无转移均无关(χ2值分别为0.722、1.660和0.501,p值分别为0.395、0.436和0.479);vm的形成与卵巢癌手术-病理分期、组织分化程度及铂类化疗敏感性均密切相关,差异有统计学意义(χ2值分别为8.744、41.903和15.781,p值分别为0.003、0.001和0.001)。cd133的表达与卵巢癌患者的年龄、组织类型及淋巴结有无转移均无关(χ2值分别为0.024、0.031和0.005,p值分别为0.878、0.985和0.941);其与手术-病理分期、组织分化程度及铂类化疗敏感性均明显相关,差异有统计学意义(χ2值分别为8.744、19.944和10.690,p值分别为0.003、0.001和0.001)。4具有vm的上皮性卵巢癌组织中cd133表达与患者临床病理资料的关系按cd133表达与vm形成的关系将120例卵巢癌患者分为cd133+vm+、cd133-vm+、cd133+vm-和cd133-vm-共4组。统计分析发现,cd133在上皮性卵巢癌vm+组和vm-组的表达分别与年龄、组织类型及淋巴有无转移均无关(χ2值分别为0.434、8.344及2.900,p值分别为0.933、0.214及0.407)。cd133在上皮性卵巢癌vm+组和vm-组的表达分别与手术-病理分期、组织分化程度及铂类化疗敏感性密切相关,差异有统计学意义(χ2值分别为14.683、51.577及25.533,p值分别为0.002、0.001及0.001)。在手术-病理分期较晚(iii~iv期)、组织分化程度较低(g3)以及铂类耐药的患者中cd133+vm+组比例明显高于其他3组,差异均有统计学意义(p值0.05)。而cd133-vm+、cd133+vm-、cd133-vm-这3组患者比例在手术-病理分期、组织分化程度及化疗敏感性方面均无明显差异(p值0.05)。5上皮性卵巢癌中vm形成与cd133表达之间的关系sepearman相关分析显示,上皮性卵巢癌组织中vm的形成与cd133的表达呈正相关关系(r=0.463,p≤0.001)。即在上皮性卵巢癌组织中,vm结构阳性中cd133的表达率较vm结构阴性者更高。6上皮性卵巢癌组织vm中cd133的表达与及患者生存率的关系120例卵巢癌患者术后进行随访,随访时间6月~72月。随访结果显示58例删失,死亡53例,死亡率为44.2%。按有无vm结构绘制kaplan-meier曲线;分析显示vm+组生存时间中位数为25.0个月,vm-组生存时间中位数为63.0个月,两组患者的生存曲线分布差异有统计学意义(χ2=29.559,p0.001)。按cd133的表达绘制kaplan-meier曲线;分析显示cd133+组生存时间中位数为25.0个月,vm-组生存时间中位数为63.0个月,两组患者的生存曲线分布差异有统计学意义(χ2=25.408,p0.001)。进一步以cd133+vm+、cd133-vm+、cd133+vm-和cd133-vm-这4组绘制kaplan-meier曲线;经log-rank检验结果显示,各组生存时间存在差异性(χ2=51.941,p0.001),其中cd133+vm+组生存时间最短,为22.0个月。第二部分人卵巢癌skov3细胞分选出的肿瘤干细胞样细胞在血管生成拟态形成中作用的初步探讨方法:采用无血清悬浮培养法培养人卵巢癌skov3细胞,分离获得悬浮生长的细胞球,经过传代培养观察其生物学特性及此类细胞的形态学变化。采用流式细胞仪检测第1、3、5、7代分选细胞cd133、cd117阳性细胞比例,采用平板克隆形成实验和小鼠体内成瘤实验鉴定第7代分选细胞生物学特性;通过matrigel三维立体培养比较第7代分选细胞与亲代skov3细胞的vm形成能力,采用rt-pcr的方法,检测第7代分选细胞与亲代skov3细胞的vm形成关键因子基质金属蛋白酶2,9(matrixmetalloproteinases-2,9,mmp-2,mmp-9)含量差异性。以上实验均重复三次。结果:1采用无血清悬浮培养人卵巢癌skov3细胞的形态学观察将skov3细胞接种于无血清培养基中,大部分沉积于培养板底,并有部分呈贴壁生长,初始形态各异,呈现圆形或者椭圆形,透明折光性较强,此后贴壁细胞逐渐增多,可形成细胞岛样结构,散布于培养瓶底部,有的细胞形成较为短小的伪足,折光性逐渐降低,24小时左右大部分skov3细胞死亡,仅小部分细胞存活并呈悬浮生长。2-4天后可见少量的悬浮细胞球形成,由3-8个细胞组成,外观不规则,细胞大小一致,且结合较为松散,具有一定的折光性。5-7天后,悬浮球细胞数量增多达数十个,体积增大,呈现圆球状外观,细胞间连接紧密,界限不清,折光性增强。随着细胞传代,悬浮细胞球数量不断增加,且体积不断增大。2流式细胞仪检测结果流式检测结果表明cd133阳性和cd117阳性细胞在skov3球形体细胞亲代skov3和每一代分选细胞中含量变化很大,亲代skov3细胞cd133阳性细胞率为0.25%,cd117阳性细胞率为0.01%;而第1、3、5、7代分选细胞中的cd133阳性细胞率分别为40.41%、70.00%、84.69%和91.58%;cd117阳性细胞率分别为14.96%、25.14%、37.73%和49.58%,cd133和cd117阳性细胞率随着分选细胞传代次数的增加明显呈上升趋势。3克隆形成实验无血清培养基中培养的第7代分选细胞和亲代skov3细胞均具有克隆形成能力,第7代分选细胞的克隆形成率为50.33%,而亲代skov3的克隆形成率为5.33%。第7代分选细胞与亲代skov3细胞克隆形成率比较差异具有统计学意义(t=15.093,p0.001)。表明第7代分选细胞具有更强的克隆形成能力。4裸鼠体内成瘤能力实验采用无血清悬浮培养的第7代分选细胞和普通培养基培养的亲代skov3细胞分别以不同的细胞密度注射于6只balb/c雌性裸鼠左、右侧大腿皮下。结果显示,接种第7代分选细胞的裸鼠右侧大腿在3周左右即可观察到肿瘤生长,而接种亲代skov3细胞的裸鼠左侧大腿在同一时期未观察到肿瘤生长。至6周时,接种第7代分选细胞的裸鼠右侧大腿均能见到肿瘤形成(6/6),成瘤率为100%,而接种亲代skov3细胞的裸鼠始终左侧大腿未见成瘤(0/6),成瘤率为0,悬浮细胞球比亲代细胞更具成瘤能力。5分选细胞与亲代skov3细胞形成vm的能力的比较matrigel基质胶中,分选细胞在1.5h开始形成vm管状结构,部分细胞伸长呈长梭形,形成突起,细胞间突起彼此连接,构成网格状。此后细胞间连接逐渐增多,管道纵横交错,连接紧密,4h后形成较为规则的网格状结构,持续时间较长,至30h结构方开始松散凋落;而skov3细胞于接种后3h才开始出现vm管状结构,部分细胞亦产生突起,但与分选细胞相比,突起数量不多。细胞间连接形成缓慢,至6h后管状样结构达最多,但规则的网格形成不多,细胞间连接不规则。6real-timepcr检测第7代分选细胞和亲代skov3细胞mmp2、mmp9的表达采用实时荧光定量pcr方法,以gapdh为内参基因,对2条目的rna进行归一化处理,分析亲代skov3细胞与悬浮细胞球中mmp-2、mmp-9基因的表达水平。根据熔解曲线,在基因扩增过程中没有明显的引物二聚体形成,证明引物的特异性较好;根据扩增曲线,随着循环数的增加荧光信号具有明显的对数期,且扩增曲线平滑,检测到的各目的基因rna的ct值在20-30之间,属于正常检测值范围,其值可信。经统计学分析悬浮细胞球的mmp-2、mmp-9基因较skov3细胞分别增高了2倍、7.6倍,差异具有统计学意义(t=-21.96,p0.001;t=-6.94,p=0.016)。第三部分不同化疗模式对裸鼠卵巢癌移植瘤血管生成拟态epha2信号通路影响的研究方法:体外无血清悬浮培养skov3细胞至第7代,将1×107细胞重悬于0.2mlpbs中,接种于6-8周龄雌性裸鼠大腿外侧皮下,接种于裸鼠,建立卵巢癌移植瘤模型。待移植瘤体积生长至150mm3-200mm3时,随机将36只裸鼠分为三组,每组12只,给予不同方式化疗,即顺铂最大可耐受剂量组(mtd-ddp组),ddp3mg/kg,1次/3日,腹腔注射,共6次;顺铂低剂量节拍化疗组(ldm-ddp组),ddp1mg/kg,1次/日,腹腔注射,共18次;对照组,等量生理盐水腹腔注射,1次/日,共计18次。采用cd31/pas双重染色法鉴定卵巢癌组织中vm和微血管结构,显微镜下分别计数vm和微血管数量,比较其差异性。采用western-blot方法检测两种化疗方式裸鼠皮下移植瘤组织中vm信号通路epha2、pi3k、ln-5γ2蛋白表达的差异性。结果:1裸鼠的一般情况45只雌性裸鼠的体重为18-20g,平均体重为(18.96±0.62)g,按照化疗方式的不同将其随机分为三组即mtd-ddp组、ldm-ddp组和对照组,mtd-ddp组裸鼠体重为(19.03±0.67)g;ldm-ddp组裸鼠体重为(18.97±0.61)g;对照组裸鼠体重为(18.87±0.62)g。三组雌性裸鼠体重比较无明显差异,无统计学意义(f=0.263,p=0.770)。化疗结束后,三组裸鼠化疗后移植瘤体重相比有统计学差异(f=32.697,p0.001),与对照组相比,mtd-ddp组裸鼠体重最轻,为(16.85±0.69)g;lsd-ddp组裸鼠体重[(17.77±0.61)g]介于mtd-ddp组与对照组[(18.65±0.51)g]之间。2裸鼠卵巢癌移植瘤模型形成情况将富集无血清悬浮培养的第7代分选细胞稀释至1×107个接种于所有雌性裸鼠右侧大腿皮下,10-14d左右均可形成卵巢癌移植瘤,45只裸鼠均能成瘤(45/45),成瘤率为100%,且随着肿瘤的生长,肿瘤体积均能达到150mm3-200mm3。其中mtd-ddp组移植瘤体积为(176.27±15.46)mm3,ldm-ddp组移植瘤体积为(178.73±14.40)mm3,对照组体积为(174.60±16.02)mm3。三组比较裸鼠移植瘤体积无显著性差异(f=0.277,p=0.760)。化疗过程中,三组裸鼠皮下移植瘤处于持续增长状态,至化疗结束后,测量剥下肿瘤体积,结果发现,三组裸鼠化疗后移植瘤体积相比有统计学差异(f=105.883,p0.001)。与对照组相比,ldm-ddp组移植瘤体积最小,为(436.33±68.29)mm3;mtd-ddp组移植瘤体积(650.93±69.60)mm3介于ldm-ddp组与对照组(802.40±69.79)mm3之间。3三组裸鼠移植瘤微血管计数、vm的差异性的比较经过cd31/pas染色,微血管由内皮细胞围成,经cd31免疫组织化学染色后,着色于血管内皮细胞膜,呈棕黄色,胞浆可见棕黄色颗粒,且过碘酸雪夫(pas)染色为阳性。若血管腔大于8个红细胞直径,且有较厚肌层的血管及硬化区域的血管视为较大血管,均不纳入计算。而vm则由cd31染色结果阴性的肿瘤细胞构成管腔样结构,pas染色阳性物质衬附其周围,未见cd31阳性的内皮细胞,部分管腔内可见红细胞。三组经过比较,结果发现,三组微血管密度比较存在差异性,具有统计学意义(f=21.115,p0.001)。经两两比较,ldm-ddp组移植瘤内微血管为(10.87±3.70),数量最少,对照组微血管最多(23.13±6.58),而mtd-ddp组微血管数量(16.33±4.85)介于ldm-ddp组与对照组之间。三组vm数量亦存在差异性,具有统计学意义(f=10.551,p0.001)。ldm-ddp组移植瘤内vm为(13.53±3.96),数量最少,mtd-ddp组vm最多(21.20±5.23),而对照组vm数量(17.33±4.44)介于ldm-ddp组与对照组之间。4移植瘤组织中调节vm生成的epha2信号通路相关蛋白的表达三组移植瘤中epha2的表达存在差异性,具有统计学意义(f=66.130,p0.001)。ldm-ddp组epha2的表达最低,mtd-ddp组epha2的表达最高,而对照组epha2的表达介于两组之间。三组移植瘤中pi3k的表达存在差异性,具有统计学意义(f=40.132,p0.001)。ldm-ddp组pi3k的表达最低,mtd-ddp组pi3k的表达最高,而对照组pi3k的表达介于两组之间。三组移植瘤中ln-5γ2的表达存在差异性,具有统计学意义(f=32.921,p0.001)。ldm-ddp组ln-5γ2的表达最低,mtd-ddp组ln-5γ2的表达最高,而对照组pi3k的表达介于两组之间。结论:1cd133在上皮性卵巢癌vm中的表达与肿瘤恶性度有关,是患者预后的重要指标。2cd133+肿瘤干细胞可能参与上皮性卵巢癌vm的发生。3采用无血清悬浮培养法培养的skov3能够分选出悬浮细胞球4经过生物学鉴定,第7代分选细胞具有肿瘤干细胞的生物学特性。5第7代分选细胞与亲代skov3细胞相比具有较强的vm形成能力,可能在vm形成中发挥作用。6ldm-ddp与mtd-ddp相比,能够更为有效的杀灭卵巢癌细胞,减少VM及微血管的形成,使肿瘤的生长受到抑制。7 LDM-DDP与MTD-DDP相比,能够抑制EphA2信号通路的EphA2、PI3K、LN-5γ2蛋白表达,可能影响VM形成。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31

【参考文献】