人肺腺癌细胞株耐吉非替尼microRNA筛选及miR-221-3p参与吉非替尼耐药的机制研究

发布时间：2018-06-21 10:12

本文选题：miRNA + Gefitinib　；参考：《中国人民解放军医学院》2017年博士论文

【摘要】：目的:以表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)为代表的分子靶向药物用于临床,治疗EGFR驱动突变的晚期非小细胞肺癌取得了惊人的疗效,但患者在中位9-13个月后,终将发生获得性耐药。EGFR基因20号外显子T790M突变是最主要的耐药机制,以Osimertinib为代表的第三代EGFR-TKIs已进入临床应用,使患者生存进一步延长。但其他的耐药机制尚无更好的办法去克服,亟待寻求新的研究途径。有证据显示miRNA与肿瘤的耐药性相关,本课题旨在筛选Gefitinib耐药相关的miRNA,并探索相关miRNA在人肺腺癌细胞株与耐药相关基因相互调控的机制。方法:PC9细胞采用逐步递增Gefitinib药物浓度、间歇作用体外诱导获得耐药细胞株PC9/GR,同时纳入人肺腺癌A549和H1975细胞株,MTT试验计算4株细胞对Gefitinib的半数抑制率(IC50),通过直接测序法获得4株细胞EGFR基因19～21外显子突变谱;利用基因芯片检测PC9与PC9/GR之间miRNA的差异表达谱,筛选出最终待研究miRNA;联合应用TargetScans, miRanda, PicTar及FindTar等生物信息学软件及网络数据库,预测miRNA的靶基因;构建miRNA过表达和低表达细胞株,MTT试验及流式细胞检测细胞耐药变化及存活率;RT-PCR和Western Blot验证靶基因和蛋白表达变化;siRNA沉默PC9靶基因,MTT及流式细胞进一步检测PC9细胞对Gefitinib敏感性的变化;双荧光素酶实验进一步检测待研究miRNA与靶基因的关系。结果:经药物诱导获得耐药细胞株PC9/GR,对Gefitinib IC50可达26.599μmol/L,本株 PC9 1.187μmol/L, A549 16.648μmol/L, H1975 9.002μmol/L;芯片检测 PC9 与PC9/GR miRNA差异表达谱,获得78个在PC9/GR中上调2倍,129个下调1/2的miRNAs;其中miR-221-3p在PC9/GR中上调2.45倍,并且RT-PCR验证miR-221-3p的表达水平在两株细胞有显著差异,p=0.0002。直接测序显示PC9细胞EGFR19 外显子 del E746-749, PC9/GR EGFR19 外显子 delE746-749, A549 EGFR 19～21全野生型,H1975 EGFR 20外显子T790M合并21 L858R。构建miR-221表达上调PC9细胞,构建miR-221表达下调PC9/GR,A549和H1975, MTT检测PC9细胞耐药性增加,IC50提高了 4倍,PC9/GR和H1975耐药性逆转,IC50分别降低了 2.6倍和2.97倍,均有统计学显著差异,而A549无显著变化。流式细胞检测过表达miR-221-3p PC9细胞在Gefitinib作用下凋亡率减少,而低表达miR-221-3p PC9/GR和H1975凋亡比例增加,A549凋亡比例变化不大。Targetscan等数据库预测miR-221-3p下游靶基因可能是CDKN1B/p27, DKK2和PTEN,在miR-221表达上调的A549细胞中3条预测靶基因表达水平与本株比较无改变(p=0.076 for DKK2,p=0.2519 for PTEN, p=0.6121 for CDKN1B/p27),而构建 miR-221 表达抑下调的PC9/GR和H1975细胞与本株相比,靶基因产生表达水平的显著升高。WB蛋白水平验证进一步证实A549细胞CDKN1B/p27, DKK2和PTEN 3条蛋白含量在改变miR-221表达前后无显著变化。而PC9和PC9/GR细胞中CDKN1B/p27蛋白含量在改变miR-221表达前后无显著变化,但DKK2和PTEN蛋白含量有显著变化。H1975细胞的3条蛋白含量均有显著变化(p=0.0183 for CDKN1B/p27,p=0.0074 for PTEN,p=0.0165 for DKK2)。siRNA沉默PC9 3条靶基因,MTT及流式细胞显示在沉默PTEN 和DKK2 后 PC9 获得对Gefitinib 的耐药性(IC50 siPTEN 2.98 倍,siDKK2 3.35倍),而沉默CDKN1B/p27后药敏无显著改变。双荧光素酶报告基因试验显示PTEN和DKK2基因是miR-221 -3p的下游靶基因。结论:miR-221-3p在肺癌耐Gefitinib细胞株PC9/GR高表达,PTEN、DKK2为miR-221-3p的靶基因,miR-221-3p通过下调PTEN和DKK2,诱导EGFR 19外显子或21外显子突变型细胞发生耐药。
[Abstract]:Objective : To investigate the relationship between the expression of EGFR gene and target gene in human lung adenocarcinoma cell line ( PC9 / GR ) . The expression level of CDKN1B / p27 , DKK2 and PTEN in A549 cells was significantly lower than that in A549 cells ( p = 0.076 for DKK2 , p = 0.2519 for PTEN , p = 0.6121 for CDKN1B / p27 ) . Conclusion : The expression of PTEN and DKK2 gene is the target gene of miR - 221 - 3P . Conclusion : The expression of PTEN and DKK2 is the target gene of miR - 221 - 3P . Conclusion : The expression of PTEN and DKK2 is the target gene of miR - 221 - 3P . Conclusion : miR - 221 - 3P can induce the resistance of EGFR 19 exon or 21 exon mutant cells by downregulating PTEN and DKK2 .
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】