建立肺癌痰液脱落细胞蛋白质组数据库及其临床应用的初步探索

发布时间：2018-06-22 12:43

本文选题：蛋白质组学 + 标志物　；参考：《北京协和医学院》2017年硕士论文

【摘要】：背景与目的肺癌是世界上癌症相关死亡率的第一位,5年生存率仅为17%。研究证明呼吸道中脱落细胞的分子改变能反映出远端肺及肺癌组织中存在的病理改变。痰与肺和呼吸道直接连接,使得存在分子异常改变的支气管上皮细胞以及肿瘤细胞转移到痰中。痰易于获得,并且无创。目前临床痰细胞学检查主要是根据细胞形态,无法检查出已发生分子改变但形态尚无明显改变的细胞,所以敏感性仅为34.53%。痰液的分子诊断技术是通过研究痰脱落细胞内的分子变化,以辅助提高痰细胞学诊断的敏感性。但,至今为止临床上尚且没有可用的高敏感性和特异性的痰生物标志物诊断肺癌,所以我们致力于在肺癌患者的痰液中寻找可用的标志物检测肺癌。随着蛋白质组学的发展,已经能鉴定到丰富的蛋白表达谱,为探索疾病的生物学特征和标志物的发现提供可靠的分析手段。本研究的目的是,建立肺癌痰脱落细胞蛋白质组数据库,并进行数据质量的评估,挖掘肺癌生物学特性相关的蛋白,并寻找临床可用的诊断标志物。方法参考临床痰液收集方法,收集15个肺癌患者痰液样本和13个慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者痰为对照样本,每例样本均进行细胞学诊断。细胞清洗液清洗痰后,离心得到痰脱落细胞。提取痰脱落细胞蛋白,变性、酶切、脱盐后,用液相色谱-串联质谱法(liquidchromatography-tandemmass spectrometry,LC-MS/MS)分析痰脱落细胞蛋白质组学。用R语言分析软件分析获得的痰脱落细胞蛋白质组数据以获得特征性的表达谱型,进而筛选出与肺癌生物学特征密切相关的差异蛋白作为候选标志物。并使用免疫细胞化学染色和免疫组织化学染色的方法,分别在肿瘤患者的痰液样本和组织样本中验证候选标志物的灵敏度与特异性。结果我们共鉴定到6706个蛋白,其中肺癌痰样本中共6609个蛋白,COPD痰样本中共6159个蛋白;其中547个蛋白只在肺癌痰脱落细胞中检测到,97个蛋白则只在COPD痰脱落细胞中检测到。我们用DAVID分析网站分析特异性表达蛋白,发现只在肺癌痰中检测到的547个蛋白主要参与线粒体转录终止与延伸、rRNA合成以及DNA复制;只在COPD痰中检测到的97个蛋白主要参与NF-Kb信号通路的正调控、mRNA转运以及适应性免疫应答等。我们基于所建立的数据库用t检验和fold change进行差异蛋白的筛选。对差异蛋白进行文献搜索和相关分子功能的了解后,挑选小泛素样修饰物激活酶亚基1(SUMO-activating enzyme subunit 1,SAE1)和Syntenin作为候选标志物进行进一步的验证。SAE1与Syntenin在肺癌痰脱落细胞中的表达水平均高于对照样本,fold change分别为为2.4和3.1。免疫细胞化学染色验证SAE1在肺癌痰的脱落细胞中的蛋白表达显著高于COPD痰液,P=0.037,敏感性为60.9%,特异性为73.9%。联合痰细胞学检查结果,诊断敏感性可达82.6%。免疫组织化学染色验证SAE1在肺癌组织中的阳性率为74.3%,显著高于癌旁组织(16.2%),P0.001;并且与肺鳞癌患者的预后显著相关,P=0.011。研究结果提示SAE1具有潜在的临床应用价值,随后我们以SAE1为基点在我们的实验数据中进行深入分析,挖掘SAE1的相互作用蛋白;共找到260个SAE1的相互作用蛋白,257046对相互作用;用REACTOME分析网站分析260个蛋白的通路,共涉及到包括DNA修复、免疫系统、信号转导、疾病、以及代谢等26个通路,并且与肿瘤相关的EGFR、WNT、NOTCH等信号通路都有密切的关系。免疫细胞化学染色验证Syntenin,在肺癌及COPD痰液脱落细胞中均为阳性表达,无统计学差异。但,免疫组织化学染色验证Syntenin,在肺癌组织中的阳性率为49.7%,显著高于癌旁组织(4.1%),P0.001;并且与非小细胞肺癌患者预后显著相关,P=0.028。结论我们初次建立了肺癌痰脱落细胞蛋白质组数据库,并对肺癌痰蛋白质组学的生物学特点进行深入分析,为以后痰液蛋白质组学的研究提供参考。并且经过验证,候选标志物SAE1可以辅助提高痰细胞学诊断敏感性,提示痰分子学检查有望应用于临床以辅助提高痰细胞学诊断的敏感性。
[Abstract]:Objective : To study the molecular changes of sputum exfoliated cells and to find out the sensitivity and specificity of the candidate markers in sputum samples and tissue samples of patients with lung cancer . The results showed that the positive rate of SAE1 in lung cancer was 74.3 % , which was significantly higher than that in adjacent tissues ( 16.2 % ) , P = 0.028 .
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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