EGFR-TKIs耐药NSCLC细胞株的建立及耐药机制的初步探讨

发布时间：2018-06-25 15:25

本文选题：非小细胞肺癌 + 表皮生长因子　；参考：《北京市结核病胸部肿瘤研究所》2016年博士论文

【摘要】：研究背景和目的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是目前我国和世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。近十几年来,分子靶向药物的应用逐渐增多,已经成为晚期NSCLC的一线治疗选择。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是NSCLC常见的癌症驱动基因。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)可以与EGFR酪氨酸激酶区域的ATP位点竞争性结合,抑制其活化及磷酸化,阻断信号下传,从而抑制肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞凋亡,最终抑制肿瘤生长。根据分子结构和作用机制的不同,EGFR-TKIs又可分为一代、二代和三代TKIs。尽管EGFR突变的晚期NSCLC患者接受EGFR-TKIs治疗的有效率可达到60%~80%,但大多数患者最终都会不可避免地出现对EGFRTKI的耐药,即继发性耐药。目前研究认为,EGFR-TKIs继发性耐药的主要机制如下:1.EGFR耐药突变,如T790M突变;2.EGFR下游通路相关分子的激活或编码基因突变;3.其他细胞增殖相关信号转导通路基因或蛋白表达异常;4.肿瘤组织上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)或向小细胞肺癌转化。但对于非EGFR耐药突变的耐药机制,仍然有诸多不明朗之处,尤其是对二代和三代TKIs药物,由于应用时间尚短,耐药机制还有待进一步研究。深入了解EGFR-TKIs的耐药机制,对TKIs的个体化治疗、预后判断、早期发现耐药患者、延缓或逆转耐药有着重要的意义。本研究中,我们选择EGFR 19外显子缺失突变的HCC827细胞系和同时具有21外显子L858R突变和20外显子T790M的NCI-H1975细胞,诱导并建立这两个细胞系对三代不同EGFR-TKIs(一代TKIs:吉非替尼;二代TKIs:阿法替尼;三代TKIs:AZD9291)的继发性耐药模型,为体外诱导TKIs耐药NSCLC探寻方法,并对耐药株EGFR和下游MAPK信号通路的蛋白表达及调节进行了检测,以探究TKIs体外耐药的可能机制。方法在第一部分实验中,为验证HCC827细胞和NCI-H1975细胞的真实性,我们先用测序法检测了这两株细胞EGFR 19-21外显子的突变,并用MTS法检测了吉非替尼、阿法替尼和AZD9291对这两株细胞的增殖抑制率,计算出相应的IC50。接下来,我们同时使用3种方法((1)间歇高浓度冲击、逐渐增加维持浓度法,(2)浓度递增法,(3)持续高浓度筛选法)试图诱导出对TKIs耐药的细胞株。获得耐药株后,我们用MTS法检测了药物对相应耐药株的增殖抑制率,并计算IC50;为除外耐药株的IC50升高并非细胞状态不佳导致,我们又绘制了不同药物浓度下耐药细胞株的生长曲线,并与亲本细胞株进行比较。在实验的第二部分中,为对耐药株的耐药机制进行探讨,我们又对耐药株的EGFR及其下游信号通路的蛋白表达进行了检测,并与亲本细胞株进行比较。我们首先用Western Blot方法检测了不同浓度药物下阿法替尼耐药株(HCC827/AR)和AZD9291耐药株(HCC827/AZDR)的EGFR和p Y1068-EGFR蛋白表达,并与亲本细胞株进行比较,再用细胞免疫荧光实验对上述结果进行了验证。我们用Western Blot方法检测了不同浓度药物下HCC827/AR和HCC827/AZDR MAPK信号通路蛋白表达与亲本细胞株的差异;在发现HCC827/AZDR细胞株存在MAPK信号通路持续活化后,我们用高选择性MEK抑制剂(曲美替尼)和ERK抑制剂(SCH772984)分别作用于HCC827/AZDR细胞,用Western Blot方法观察MAPK信号通路下游蛋白ERK磷酸化的情况;又用MTS增殖抑制实验检测了曲美替尼对AZD9291活性的影响。结果在实验的第一部分,我们验证了HCC827细胞和NCI-H1975细胞后,用间歇高浓度冲击、逐渐增加维持浓度法诱导了HCC827吉非替尼耐药株(HCC827/GR),经过三轮冲击维持,最终吉非替尼维持浓度为300n M,细胞可正常生长。MTS增殖抑制实验法显示相同浓度的吉非替尼对HCC827/GR的抑制率始终低于亲本细胞株(P0.05)。生长曲线实验显示HCC827/GR细胞在吉非替尼30n M时生长速度和不加药一致(P0.05),但在吉非替尼300n M时生长速度比不加药时慢(P0.05)。在浓度递增法持续诱导7个月后,我们获得了阿法替尼耐药株HCC827/AR,阿法替尼维持浓度为16n M,细胞可正常生长。MTS增殖抑制实验测得HCC827/AR的IC50为4667 n M,耐药指数1866.8。生长曲线实验显示HCC827/AR的生长速度与亲本细胞株无明显差异,在阿法替尼16n M时生长速度和没有药物作用时一致(P0.05)。经过6个月的间歇高浓度冲击、逐渐增加维持浓度,我们最终获得了AZD9291耐药株HCC827/AZDR,维持浓度为160n M,细胞可正常生长。MTS增殖抑制实验测得HCC827/AZDR的IC50为6116 n M,耐药指数459.8。生长曲线实验显示HCC827/AZDR的生长速度与亲本细胞株无差异,在AZD9291 160n M时的生长速度和不加药组一致(P0.05)。实验的第二部分中,Western Blot结果显示耐药株HCC827/AR细胞和HCC827/AZDR细胞的EGFR的蛋白含量和p Y1068位点磷酸化水平均比亲本细胞株明显降低(P0.01)。随着阿法替尼或AZD9291浓度的增高,HCC827细胞、HCC827/AR细胞和HCC827/AZDR细胞的p Y1068-EGFR水平减低,EGFR表达水平增高(P0.05)。细胞免疫荧光结果显示与亲本细胞相比,HCC827/AZDR细胞的EGFR和p Y1068-EGFR水平降低。与亲本细胞相比HCC827/AR细胞的p MEK蛋白含量降低,与阿法替尼药物浓度的变化无量效关系;p ERK 1/2的表达水平降低,与阿法替尼的药物浓度无量效关系。与亲本细胞比,HCC827/AZDR细胞的p MEK水平升高,AZD9291浓度增加不能降低p MEK的表达;p ERK 1与亲本细胞株无明显差异;p ERK 2的蛋白含量明显升高,AZD9291作用的浓度增加不能降低p ERK 2的蛋白含量。曲美替尼在10n M可明显降低HCC827/AZDR的p ERK 1/2表达(P0.05);SCH772894在100n M浓度时可抑制HCC827/AZDR的p ERK1/2表达(P0.05)。但MTS增殖抑制实验检测曲美替尼10n M浓度下AZD9291的IC50为6215n M,与AZD9291单药测定的IC50无统计学差异。结论1.我们通过浓度递增法成功获得了耐阿法替尼的HCC827/AR细胞株,通过间歇高浓度冲击、逐渐增加维持浓度法获得了耐AZD9291的HCC827/AZDR细胞株。2.HCC827/AR和HCC827/AZDR耐药细胞中,EGFR的表达和p Y1068位点磷酸化水平均比亲本细胞株明显降低,研究表明HCC827/AR和HCC827/AZDR细胞株可能通过下调EGFR的表达引起对EGFR-TKIs的耐药。3.HCC827/AZDR耐药株与亲本细胞相比出现了MAPK信号通路的持续高水平激活。但应用曲美替尼并不能改善HCC827/AZDR细胞对AZD9291的耐受性,MAPK信号通路的持续活化不是HCC827/AZDR耐药的关键机制。
[Abstract]:EGFR - TKIs ( epidermal growth factor receptor , EGFR ) is one of the most common cancer - driven genes in NSCLC . EGFR - TKIs can be divided into one - generation , second - generation and three - generation TKIs . In the second part of the experiment , we examined the expression of EGFR and p - YG8 - EGFR in vitro and compared the expression and regulation of EGFR and p The growth rate of HCC827 / AZDR was significantly lower than that of parent cell line ( P0.05 ) . The continuous activation of MAPK signaling pathway is not a key mechanism for HCC827 / AZDR resistance .
【学位授予单位】：北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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