PDCD4在炎—癌转化及血管慢性炎症中的作用及机制

发布时间：2018-07-03 08:06

  本文选题：PDCD4 + 结肠炎　； 参考：《山东大学》2016年博士论文

【摘要】：研究目的程序性凋亡蛋白-4(programmed cell death protein 4,PDCD4)因其在凋亡细胞中表达上调被发现而得此名,已有的研究证实PDCD4可在转录水平和翻译水平抑制多种蛋白分子的表达,具有抑癌基因的作用,可抑制多种肿瘤的生长、侵袭和迁移。此外,研究表明,PDCD4在一些炎症性疾病中也具有重要的作用。在小鼠中,我们和其他学者的研究发现PDCD4可以促进I型糖尿病、实验性变态反应性脑脊髓炎、动脉粥样硬化以及肥胖相关炎症等炎症性疾病的发生发展。而我们还发现PDCD4在脂多糖/D-半乳糖苷诱导的急性肝损伤中则可以起到一种保护作用。因此,PDCD4在炎症过程中的作用仍不十分确定,尚需加强相关研究以进一步明确。另外,最近几年的研究显示炎症与肿瘤的转化密切相关,而PDCD4是否在炎-癌转化中发挥作用尚不清楚。炎性肠病(inflammatory bowel diseases,IBDs)也是一种重要的炎症性疾病,而PDCD4对于炎性肠病的作用仍有待研究。炎性肠病是一种肠道慢性非特异性炎症性疾病,包括克罗恩病(Crohn's disease, CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)两种主要类型。炎性肠病的发病原因目前尚不十分明了,其可能的发病原因包括遗传因素、肠道屏障功能受损、肠道微生物改变和免疫失调等多种因素。炎性肠病可以显著提升结肠癌的发病风险,而其中溃疡性结肠炎患者发生结肠癌的风险更高。结肠炎诱发结肠癌的机制目前尚不清楚,一般认为,肠道的慢性炎症可以促进肠道黏膜的恶性转化,从而最终导致结肠癌。目前的研究认为,动脉粥样硬化是脂质代谢异常所导致的一种慢性炎症性疾病,数据显示许多炎症因子和免疫细胞参与动脉粥样硬化发生的病理过程。而最新的研究认为,在动脉粥样硬化的发病过程中,血管周围脂肪在其中起到了至关重要的作用。以往认为,血管周围脂肪的作用仅仅是对血管进行保护,但最近的相关研究显示,血管周围脂肪可以通过分泌一些具有代谢活性的脂肪因子、趋化因子和激素样因子影响心血管系统的功能以及相关疾病的发生发展。我们的前期研究证实,PDCD4可以促进小鼠动脉粥样硬化的发生并可在动脉粥样硬化发生发展的过程中影响血管壁的慢性炎症过程。由于血管周围脂肪对于动脉粥样硬化亦有重要影响,因此,PDCD4亦有可能通过调控血管周围脂肪的炎症表型从而导致动脉粥样硬化的发生。为了阐明PDCD4在炎性肠病及相关肠道肿瘤中的作用,和PDCD4对于血管周围脂肪及其炎症表型的影响,本论文从以下两个方面进行研究：一、PDCD4对小鼠急性结肠炎和结肠炎相关结肠癌的调控作用及其分子机制研究发现PDCD4的缺失可以明显促进小鼠急性结肠炎；证明PDCD4缺失对结肠炎相关结肠癌的发生发展具有促进作用；发现PDCD4可以通过调控IL-6/STAT3信号通路从而在小鼠结肠炎相关结肠癌的发生发展过程中发挥保护性作用；二、PDCD4对血管周围脂肪炎症表型的影响发现PDCD4可以影响血管周围脂肪的炎症表型和白色脂肪化,从而影响邻近血管血管壁病变的形成。研究方法一、PDCD4对小鼠急性结肠炎和结肠炎相关结肠癌的调控作用及其分子机制(一)使用Pdcd4-/-小鼠和野生型小鼠,利用DSS诱导小鼠急性结肠炎模型。测量小鼠体重、检测大便潜血等临床指标,计算疾病指数。利用HE染色分析小鼠肠道病理改变并计算炎症积分。(二)使用Pdcd4-/-小鼠和野生型小鼠,联合应用AOM和DSS诱导小鼠结肠炎相关结肠癌模型。使用免疫组化的方法检测病程不同阶段野生型小鼠肠道局部PDCD4的表达水平。通过HE染色分析小鼠肠道病理改变并计算炎症积分,分析肿瘤的大小、数量及位置。(三)提取小鼠肠道组织RNA并合成cDNA,使用实时荧光定量PCR检测TNF-α、IL-6等细胞因子的表达。体外培养小鼠肠道组织,取培养上清液,应用ELISA法检测上清液中TNF-α、IL-6等细胞因子的水平。取小鼠血清,应用ELISA法检测小鼠血清中TNF-α、IL-6等细胞因子的表达。(四)通过免疫组化的方法检测结肠炎相关结肠癌病程早期小鼠肠道上皮细胞增殖情况。(五)通过免疫荧光染色分析结肠炎以及结肠炎相关结肠癌不同病程阶段小鼠肠道局部p-STAT3的表达水平。(六)取Pdcd4-/-小鼠和野生型小鼠的腹腔巨噬细胞、骨髓来源巨噬细胞,通过LPS刺激产生IL-6,使用ELISA法分析IL-6的表达水平。(七)在小鼠结肠癌细胞系中使用PDCD4干扰体系,CCK8法检测IL-6/STAT3信号通路相关细胞增殖。Western-blot法检测PDCD4对IL-6/STAT3信号通路活化的影响。并使用STAT3抑制剂重复上述实验确证PDCD4对IL-6/STAT3信号通路及其相关细胞增殖的影响。(八)使用Pdcd4-/小鼠和野生型小鼠,体内应用sgp130Fc阻断IL-6/STAT3信号通路的活化,联合应用AOM和DSS建立小鼠结肠炎相关结肠癌模型,观察结肠炎相关结肠癌病程早期小鼠肠道上皮增殖情况的改变。二、PDCD4对血管周围脂肪炎症表型的影响(一)使用Apoe-/-小鼠和Apoe-/-小鼠(DKO)高脂喂养19周,建立动脉粥样硬化模型。(二)检测小鼠体重变化,观察小鼠胸主动脉、腹主动脉周围脂肪外观,留取胸主动脉、腹主动脉大体标本。并剥离小鼠胸腹主动脉周围脂肪、肠系膜脂肪、附睾脂肪,提取各部位脂肪组织RNA并合成cDNA,使用实时荧光定量PCR检测各脂肪因子、趋化因子、细胞因子的表达。HE染色观察小鼠胸主动脉周围脂肪组织形态。(三)将取自高脂喂养8周后的Apoe-/-小鼠和DKO小鼠的胸腹主动脉周围脂肪以及附睾脂肪分别移植入高脂喂养2周的Apoe-/-小鼠左侧颈动脉周围,观察在Apoe-/-小鼠中,相应脂肪组织对紧邻血管的血管壁病变形成的影响。结果一、PDCD4对小鼠急性结肠炎和结肠炎相关结肠癌的调控作用及其分子机制(一) PDCD4缺失可促进DSS诱导的小鼠急性结肠炎1. PDCD4缺失显著加重小鼠结肠炎相关临床症状结果显示,Pdcd4-/-小鼠和野生型小鼠相比结肠炎的程度明显加重,体重下降比野生型小鼠更为明显。和野生型小鼠相比,Pdcd4-/-小鼠表现出了更为严重的血便,因此疾病指数也明显高于野生型小鼠。证明PDCD4的缺失可以显著加重小鼠急性结肠炎。2. PDCD4缺失加重结肠炎小鼠肠道局部病理改变通过HE染色发现,Pdcd4-/-小鼠和野生型小鼠相比,在肠道局部表现出了更严重的炎症病理改变,如炎性细胞浸润、肠道上皮损伤、局部水肿等。并且其炎症起病更早。Pdcd4-/-小鼠的炎症积分明显高于野生型小鼠,进一步证明PDCD4的缺失可以加重小鼠急性结肠炎。(二) PDCD4基因缺失促进小鼠结肠炎相关结肠癌的发生发展1. PDCD4在小鼠肠道局部的表达随结肠炎相关结肠癌病程进展而降低结果显示,随着结肠炎相关结肠癌病程的进展,在野生型小鼠肠道局部,PDCD4的表达明显呈下调趋势。至结肠癌阶段PDCD4的表达已完全缺失。提示PDCD4在结肠炎相关结肠癌疾病过程中具有重要作用。2.结肠炎相关结肠癌病程早期肠道局部炎症结果显示,在小鼠结肠炎相关结肠癌病程的早期,Pdcd4-/-小鼠和野生型小鼠的肠道局部均表现出慢性炎症的特征,而其中Pdcd4-/-、鼠的炎症积分略高于野生型小鼠。3. PDCD4对结肠炎相关结肠癌肿瘤大小、数量、位置的影响结果表明,Pdcd4-/-小鼠和野生型小鼠在结肠炎相关结肠癌病程的晚期,肿瘤位置大多位于结肠远端。且Pdcd4-/-小鼠和野生型小鼠相比,肿瘤的体积明显增大、数量明显增多。证明PDCD4的缺失可以促进结肠炎相关结肠癌的发生发展。(三) PDCD4基因缺失在小鼠结肠炎相关结肠癌病程早期可促进肠道上皮细胞增殖结果表明,Pdcd4-/-小鼠和野生型小鼠相比,在结肠炎相关结肠癌病程的早期,肠道上皮的增殖明显增强,证明PDCD4可以调控结肠炎相关结肠癌疾病过程中肠道上皮的增殖。(四) PDCD4基因缺失使结肠炎小鼠肠道局部TNF-α、IL-6表达水平上调1. PDCD4在蛋白水平影响TNF-α、IL-6的表达结果表明,体外培养结肠炎造模后Pdcd4-/-小鼠和野生型小鼠肠道组织的培养上清中,TNF-α、IL-6均有明显上升,其中IL-6的表达量明显高于TNF-α,并且PDCD4对IL-6的调控作用也较TNF-α显著。证明PDCD4对TNF-α、IL-6在蛋白水平上具有调控作用。2. PDCD4对于TNF-α、IL-6的表达在转录水平上的影响结果显示,在Pdcd4-/-小鼠和野生型小鼠肠道局部,PDCD4基因的缺失在转录水平上对IL-6的表达并无影响,而自结肠炎病程的第5天起,在转录水平上明显提高了TNF-a的表达。3. PDCD4基因缺失使结肠炎小鼠血清中IL-6水平升高结果显示,在结肠炎造模后的Pdcd4-/-小鼠和野生型小鼠血清中,PDCD4基因缺失使小鼠血清中IL-6的水平明显升高。进一步证明了PDCD4对于IL-6的调控作用。(五)PDCD4缺失在小鼠体内促进了IL-6/STAT3信号通路的活化结果显示,在结肠炎以及结肠炎相关结肠癌病程的各阶段,Pdcd4-/-小鼠和野生型小鼠相比肠道局部p-STAT3的表达明显上调,证明PDCD4的缺失能明显促进IL-6/STAT3通路的活化。(六)PDCD4缺失使小鼠巨噬细胞IL-6分泌增加结果表明,在腹腔巨噬细胞和骨髓来源的巨噬细胞中,PDCD4的缺失均能明显上调IL-6的表达。提示PDCD4对免疫细胞产生IL-6的调控作用是PDCD4调控结肠炎以及结肠炎相关结肠癌的主要机制。(七)PDCD4缺失促进了小鼠结肠癌上皮细胞与IL-6相关的细胞增殖1. PDCD4缺失的小鼠结肠癌上皮细胞的IL-6相关细胞增殖增强结果显示,在小鼠结肠癌上皮细胞系中使用PDCD4沉默体系降低PDCD4的表达之后,在IL-6刺激之前,对于细胞增殖无明显影响；而在IL-6刺激存在的情况下,PDCD4的缺失可以明显促进小鼠结肠癌上皮细胞系的增殖。证明PDCD4的缺失可以促进小鼠结肠癌上皮细胞中IL-6相关的细胞增殖。2. PDCD4缺失使小鼠结肠癌上皮细胞IL-6/STAT3信号通路活化增强结果显示,在PDCD4缺失的小鼠肠道上皮细胞中,使用IL-6刺激之后可明显增强p-STAT3的表达,证明在小鼠肠道上皮细胞中PDCD4的缺失可以明显促进IL-6/STAT3信号通路的活化。3.阻断小鼠结肠癌上皮细胞中的IL-6/STAT3信号PDCD4对IL-6相关细胞增殖的影响消失结果显示,在使用了STAT3阻断剂之后,PDCD4对于小鼠结肠癌上皮细胞IL-6相关细胞增殖的调控作用消失,进一步证明了PDCD4通过调控IL-6/STAT3信号通路调节小鼠肠道上皮细胞IL-6/STAT3信号通路相关细胞增殖的作用。(八)体内阻断IL-6/STAT3信号通路对于小鼠结肠炎相关结肠癌病程早期肠道上皮细胞增殖的影响结果表明,在使用了sgp130Fc体内特异性阻断IL-6/STAT3信号通路之后,在结肠炎相关结肠癌病程的早期,Pdcd4-/-小鼠和野生型小鼠之间在肠道上皮细胞增殖方面的差异消失了。进一步证明PDCD4是通过调节IL-6/STAT3信号通路来调节小鼠肠道上皮细胞的增殖。二、PDCD4对高脂诱导血管周围脂肪及其相关炎症的影响(一)PDCD4对Apoe-/-小鼠体重及血管周围脂肪重量无影响结果表明,高脂喂养19周之后,PDCD4在Apoe-/-小鼠中对于小鼠的体重并无影响。PDCD4对于高脂喂养8周后的Apoe-/-小鼠血管周围脂肪的外观和重量亦无影响。(二)PDCD4缺失的血管周围脂肪具有抗炎表型1.PDCD4缺失的血管周围脂肪高表达脂联素和PPAR-γ结果表明,PDCD4基因的缺失使得高脂喂养19周之后的Apoe-/-小鼠胸主动脉周围脂肪中的脂联素水平明显上调,而在肠系膜脂肪中,PDCD4基因的缺失则可以显著上调PPAR-γ的表达。而这两种脂肪因子均具有一定的抑炎性。此外PDCD4基因对于Apoe-/-小鼠体内瘦素的表达无明显影响。2.PDCD4基因的缺失上调血管周围脂肪中抗炎性细胞因子TGF-p的表达结果显示,PDCD4基因缺失可以在高脂喂养19周之后的Apoe-/-小鼠肠系膜脂肪中显著提高抑炎性细胞因子TGF-β的表达水平。PDCD4对于IL-10的表达无明显影响。3.PDCD4基因的缺失显著降低了血管周围脂肪中促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、 IFN-γ的表达结果表明,PDCD4基因的缺失可以显著降低高脂喂养19周之后的Apoe-/-小鼠胸主动脉周围脂肪和腹主动脉周围脂肪中IL-1p的表达,同时还能够显著降低Apoe-/-小鼠腹主动脉周围脂肪中IFN-y的水平。而在肠系膜脂肪中,PDCD4的缺失则可以显著降低IL-6的表达。这些数据表明,PDCD4的缺失在各处脂肪中均能够抑制促炎性细胞因子的表达。4.PDCD4基因缺失降低了趋化因子MCP-1的表达水平结果显示,在高脂喂养19周之后的Apoe-/-小鼠的腹主动脉周围脂肪中,PDCD4的缺失显著下调了趋化因子MCP-1的表达水平,而对IL-8的表达无明显的调控作用。以上结果表明PDCD4基因的缺失能够促使Apoe-/-小鼠的血管周围脂肪产生具有抑炎倾向的炎症表型。(三)PDCD4基因缺失能轻度延缓高脂诱导的胸主动脉周围棕色脂肪细胞的白色化结果表明,在高脂喂养19周之后的Apoe-/-小鼠胸主动脉周围脂肪中,PDCD4基因的缺失可以显著提高棕色脂肪标记物CIDEA的表达水平,对另外的棕色脂肪及白色脂肪标记物UCP-1、αP2、HOXC9无明显影响。HE染色的结果显示PDCD4的缺失可以使Apoe-/-小鼠胸主动脉周围脂肪白色化的程度有一定的减轻。这些结果提示PDCD4对于小鼠胸主动脉周围脂肪的棕色化可能具有一定的影响。(四)PDCD4于不同位置的脂肪组织炎症表型及脂肪白色化的调控作用不同结果显示,PDCD4对于高脂喂养19周之后的Apoe-/-小鼠不同位置的脂肪组织炎症表型的影响并不十分一致。PDCD4的缺失对IL-1p的下调作用存在于胸、腹主动脉周围脂肪。在胸主动脉周围脂肪中,PDCD4的缺失可以上调脂联素的表达；在腹主动脉周围脂肪中,PDCD4的缺失可以降低MCP-1、IFN-γ的水平；在肠系膜脂肪中,PDCD4的缺失则可以下调IL-6的表达,提高PPAR-γ、TGF-β的水平。此外,PDCD4对于Apoe-/-小鼠胸主动脉周围脂肪的棕色化也有一定的影响,其缺失能够显著提高棕色脂肪标记物CIDEA的表达。而尽管PDCD4的缺失能够使Apoe-/-小鼠血管周围脂肪的炎症表型产生明显的抑炎性倾向,并在一定程度上调控其棕色化,但对于Apoe-/-小鼠内脏脂肪的炎症表型则无明显的影响。说明血管周围脂肪组织对于PDCD4对小鼠脂肪炎症表型的调控作用更加敏感。(五)PDCD4缺失的血管周围脂肪能够抑制其邻近血管血管病变的发生将Apoe-/-小鼠及DKO小鼠胸腹主动脉周围脂肪及附睾脂肪分别移植入Apoe-/-小鼠左侧颈动脉周围之后发现,移植了Apoe-/-胸腹主动脉周围脂肪和Apoe-/-附睾脂肪的小鼠颈动脉血管壁和假手术组小鼠相比出现增厚的现象,而移植了DKO胸腹主动脉周围脂肪和DKO附睾脂肪的小鼠颈动脉血管壁并未出现增厚。提示血管周围脂肪中的PDCD4能够促进邻近血管病变的发生。结论1. PDCD4可以通过调控IL-6/STAT3通路及其介导的细胞增殖从而在急性结肠炎和结肠炎相关结肠癌的发生发展中发挥保护性作用。2. PDCD4可以对小鼠胸、腹主动脉周围脂肪以及肠系膜脂肪、附睾脂肪的棕色化和炎症表型分别产生不同的影响,并由此调控邻近血管病变的发生。创新性及研究意义1.首次证实PDCD4的缺失可以通过促进IL-6/STAT3信号通路的活化促进小鼠肠道上皮细胞的增殖,从而促进小鼠结肠炎相关结肠癌的发生。为利用PDCD4治疗结肠炎和结肠炎相关肿瘤提供了依据。2.首次证明PDCD4可以对小鼠血管周围脂肪棕色化及炎症表型产生影响并由此可影响邻近血管病变的发生,为理解血管周围脂肪炎症表型及其相关分子机制提供了新的思路,为干预治疗提供新的靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
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本文编号：2092976