FOXP3对结肠癌干细胞自我更新的影响及其机制研究

发布时间：2018-07-07 08:22

  本文选题：FOXP3 + COX2　； 参考：《第四军医大学》2017年博士论文

【摘要】：背景结肠癌是发病率较高的癌症之一,经传统治疗后经常发生复发、转移,虽然其具体的机制至今仍未完全阐明,但是肿瘤内少数具有自我更新、无限分化以及化疗抵抗的肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)的存在被认为在肿瘤复发和转移过程中起着主要的作用。近年来,用CSCs理论来解释肿瘤的复发、转移受到了科学家们的广泛认可,因此,清除CSCs在肿瘤的治疗过程中十分重要。环氧合酶-2(COX2)是环氧合酶(COX)同工酶中的一种,它是花生四烯酸向前列腺素(包含前列腺素E2,PGE2)代谢转化所必需的酶。研究发现,COX2和PGE2在促进干细胞自我更新过程中发挥了很重要的作用。近年来也有研究发现:COX2在结肠癌以及其它种类CSCs中表达上调;COX2特异性抑制剂可以降低结肠癌干细胞样球体(Colonosphere)的形成效率(Sphere formation efficiency)。但是COX2在结肠癌干细胞(Colon Cancer Stem Cells,CCSCs)中异常表达的机制还不是很明了。因此,寻找能够抑制COX2的分子在CCSCs的研究中十分重要。FOXP3(Forkhead box protein 3)是Forkhead转录因子家族成员之一,是调节性T细胞(Regulatory cells,Tregs)标志性分子,通过调节Tregs细胞功能发挥免疫抑制作用。近年来的研究表明,FOXP3也高表达于结肠癌以及其它肿瘤细胞中。在乳腺癌、卵巢癌以及其它癌症中发挥抑癌作用。我们课题组在胃癌的研究中证明,FOXP3可以通过与NF-κB的相互作用抑制其活性,进而抑制COX2的表达水平,从而发挥对肿瘤的抑制功能。这提示FOXP3是一个具有抑癌作用的基因,能够通过与NF-κB相互作用抑制肿瘤。但是FOXP3在CSCs形成和自我更新中的作用尚不清楚。目的本研究主要深入研讨FOXP3对CCSCs自我更新的影响及其具体的分子机制。方法1.通过几种不同的人结肠癌细胞系在特定培养基中富集培养Colonosphere;通过Real-Time PCR和Western Blot实验分析结肠癌细胞和Colonosphere中FOXP3和COX2的表达差异以及其相关性。2.通过感染腺病毒的方法过表达/干涉结肠癌细胞HT29中FOXP3的表达量,然后培养Colonosphere;通过显微镜观察分析过表达/干涉FOXP3对Colonosphere形成效率的影响;通过侧群细胞(Side population cells,SP)实验分析过表达/干涉FOXP3对SP细胞比例的影响;通过Real-Time PCR分析过表达/干涉FOXP3对CCSCs表面标志物的影响;通过小鼠移植瘤实验分析过表达/干涉FOXP3对CCSCs在小鼠体内成瘤能力的影响。3.通过免疫共沉淀(Co-IP)实验分析FOXP3和NFκB亚基p65蛋白相互作用;通过Real-Time PCR和Western Blot分析过表达/干涉FOXP3对COX2基因和蛋白质表达水平的影响以及同时干涉FOXP3和p65对COX2基因和蛋白质表达水平的影响;通过Luciferase报告基因分析过表达FOXP3对COX2启动子活性的影响以及过表达FOXP3的同时利用TNFα诱导p65入核对COX2启动子的影响;染色质免疫沉淀分析(CHIP)实验检测FOXP3是否与COX2启动子中的p65位点结合。4.通过感染腺病毒的方法培养干涉FOXP3、干涉COX2以及同时干涉FOXP3和COX2的结肠癌细胞HT29,然后培养Colonosphere;通过显微镜观察分析干涉COX2对由低表达FOXP3引起的Colonosphere形成效率增强的影响;通过SP实验分析干涉COX2对由低表达FOXP3引起的SP细胞比例增高的影响;通过Real-Time PCR分析干涉COX2对由低表达FOXP3引起的CCSCs表面标志物表达水平升高的影响;通过小鼠移植瘤实验分析干涉COX2对由低表达FOXP3引起的CCSCs在小鼠体内成瘤能力增强的影响。结果1.在几种结肠癌细胞系中成功富集得到了经典的神经样球体Colonosphere,通过Real-Time PCR以及流式细胞术分析发现,与结肠癌细胞相比,Colonosphere中CCSCs表面标志物表达水平显著升高,能够将其视为CCSCs来开展后面的实验。Real-Time PCR和Western Blot检测发现:与对应的人结肠癌细胞相比,FOXP3在CCSCs中的表达水平有明显的降低;而作为FOXP3下游靶基因的COX2,随着FOXP3在CCSCs中表达量的降低,其表达量有显著升高。在CCSCs中,两者的表达水平呈负相关。2.通过在显微镜下观察分析过表达/干涉FOXP3的HT29培养的Colonosphere,结果表明,过表达FOXP3可以降低Colonosphere的形成效率;SP实验结果表明,过表达FOXP3可以降低SP细胞的比例;Real-Time PCR检测结果表明,过表达FOXP3可以降低CCSCs多种表面标志物的表达水平;小鼠移植瘤实验结果显示,过表达FOXP3可以降低CCSCs在小鼠体内形成肿瘤的能力。相反,干涉FOXP3可以增强Colonosphere的形成效率;增高SP细胞的比例;增高CCSCs表面标志物的表达水平;增强CCSCs在小鼠体内形成肿瘤的能力。3.免疫共沉淀实验结果表明,CCSCs中存在着FOXP3与p65蛋白相互作用;Real-Time PCR和Western Blot实验结果表明,过表达FOXP3可以降低CCSCs中COX2的m RNA和蛋白表达水平;相反,干涉FOXP3可以升高CCSCs中COX2的m RNA以及蛋白质的表达水平;而在干涉FOXP3的同时干涉p65,由低表达FOXP3引起的COX2 m RNA以及蛋白质的表达量升高的作用会受到拮抗;Luciferase报告基因结果显示,过表达FOXP3可以降低COX2启动子的活性,而由TNFα诱导的p65入核可以拮抗由高表达FOXP3引起的COX2基因启动子活性受到抑制的作用;CHIP实验结果显示,FOXP3可以和COX2基因启动子上的p65位点相互结合。4.通过在显微镜下观察分析干涉FOXP3以及同时干涉FOXP3和COX2的HT29培养的Colonosphere,结果表明,干涉FOXP3可以增强Colonosphere的形成效率;SP实验结果表明,干涉FOXP3可以增加SP细胞的比例;Real-Time PCR检测结果显示,干涉FOXP3可以增强CCSCs表面标志物的表达水平;小鼠移植瘤实验结果表明,干涉FOXP3可以增强CCSCs在小鼠体内的形成肿瘤的能力。而在干涉FOXP3的同时干涉COX2,由低表达FOXP3引起的这些CCSCs自我更新能力增强的作用会受到抑制。结论在CCSCs中,FOXP3表达下调,而COX2表达上调,两者的表达水平呈负相关。FOXP3可以显著降低CCSCs的自我跟新能力。FOXP3可能通过与p65相互作用从而抑制NFκB介导的COX2转录激活。FOXP3通过COX2对CCSCs的自我更新起着负性调节的作用。因此,我们得出结论:FOXP3可能通过FOXP3/NFκB-COX2信号轴抑制CCSCs的自我更新。
[Abstract]:Background : The presence of COX - 2 ( COX2 ) plays an important role in tumor recurrence and metastasis . In recent years , it has been found that COX2 and PGE2 play an important role in promoting the self - renewal of stem cells . In the study of gastric cancer , the effect of overexpression / interference FoxP3 on the expression of COX2 gene and protein expression level in colon cancer cells and other tumor cells was analyzed . The effect of overexpression / interference FoxP3 on the expression of COX2 gene and protein was analyzed by means of Real - Time PCR and Western Blot . The results showed that overexpression of FoxP3 could decrease the expression level of COX2 in CCSCs . The results showed that overexpression of FoxP3 could decrease the expression of COX2 in CCSCs . There is a negative correlation between the expression levels of CCSCs , which can significantly reduce the self and the ability of CCSCs .
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.35
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本文编号：2104365