辐射诱导型SOD2过表达慢病毒载体的构建及其在结肠癌放疗中的辐射防护和放疗增敏效应

发布时间：2018-07-07 18:28

  本文选题：放射-基因治疗 + 辐射防护　； 参考：《重庆医科大学》2016年博士论文

【摘要】：背景放疗是肿瘤综合性治疗中不可或缺的核心技术之一,在对肿瘤的局部控制中,辐照不可避免的会对肿瘤周围的正常组织造成损伤。为降低辐照对正常组织的损伤,辐照的剂量和时间会受到严格限制,在一定程度上也制约了放疗的治疗效果。多叶准直器、精确的固定技术、辐射防护剂等常用来减轻放射性损伤,但是效果并不理想,并且辐射防护剂缺乏靶向性,同时也会对肿瘤组织起到保护作用,从而降低了放疗的效果。放疗增敏剂也存在类似的问题,在对肿瘤起到放疗增敏效应的同时,往往也会增强照射野内正常组织的敏感性,导致放射损伤加重。基因治疗是目前肿瘤治疗的热点,通过激活抑癌基因、引入细胞毒性基因、阻断癌基因、提高肿瘤免疫原性、改变肿瘤微环境等策略起到有效的抑瘤作用。SOD2是定位于细胞线粒体内的超氧化物歧化酶,可以清除细胞内的氧自由基,是细胞对抗氧化损伤的重要机制,也被视为效果确切的辐射防护剂。另有多项研究表明,SOD2具有抑癌基因的作用,能抑制肿瘤的增殖和转移,并且能提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性。然而,由于目前缺乏靶向辐射野的有效基因转染方法以及对导入的基因表达进行调控,从而限制了SOD2基因治疗在临床的推广应用。Egr-1基因的启动子区域含有6个CAr G盒,该区域为辐照诱导调控序列,可直接感受辐照刺激。构建含有CAr G盒的嵌合启动子,可以优化启动子的启动效率,降低本底表达。通过构建下游连接SOD2基因的辐射诱导型嵌合启动子,有望通过控制辐照剂量和时间对SOD2基因的表达进行精确调控,赋予SOD2基因治疗时空限制性表达的特点。目的为解决目前放疗增敏中 增敏肿瘤和正常损伤加重并存‖的临床难题,本课题尝试构建辐照诱导型嵌合启动子驱动的SOD2慢病毒过表达载体,通过控制辐照的剂量和时间,不仅可以实现靶向性、可调控性基因治疗,还同时实现对肿瘤的放疗增敏作用和对正常组织的辐射保护作用。这样在肿瘤放疗时兼有保护正常组织和抑制肿瘤细胞的作用,不仅可以提高肿瘤的放射治疗的效果,还能减低放疗对正常组织的损伤,提高肿瘤患者的生存质量;鉴于此,靶向SOD2的基因治疗有望在今后的肿瘤放射治疗中有较好的应用前景。方法1.含有报告基因和治疗基因的慢病毒制备:全基因合成含有CAr G盒-CMV基础启动子的嵌合启动子片段,以慢病毒载体p LVX-Ac GFP1-N1为骨架,分3步克隆策略构建辐照诱导型启动子驱动的治疗基因慢病毒载体p LVX-C9BC-SOD2-T2A-Ac GFP1和报告基因慢病毒载体p LVX-C9BC-Ac GFP1-N1。经酶切、测序验证构建成功后,扩增转化的stbl3菌株,去内毒素大提质粒,以293FT细胞株为工具细胞,三质粒慢病毒包装系统进行慢病毒包装,测定病毒滴度。2.嵌合启动子的辐射诱导特性和量化调控特征:报告基因慢病毒和治疗基因慢病毒分别感染HT-29细胞株和CCD841 Co N细胞株,药物筛选后得到稳定转染细胞株。以不同的照射剂量处理稳转细胞株后,不同时间点观察HT-29和CCD 841 Co N稳转细胞株报告基因和治疗基因的表达,以明确辐照诱导型启动子的启动活性和特点。3.稳转细胞株辐射处理后SOD2表达及表型变化:HT-29和CCD 841 Co N稳转细胞株辐照处理后,检测下游治疗基因SOD2的表达;观察不同处理组的细胞增殖、生长、凋亡的变化。4.辐射启动SOD2基因治疗裸鼠移植瘤的体内实验研究:首先用HT-29细胞株建立BALB/c裸鼠移植瘤模型。荷瘤模型构建成功后,局部注射治疗基因慢病毒并在72h后给予辐照处理,观察治疗基因表达情况以及肿瘤生长曲线、组织病理学变化和原位凋亡情况。结果1.成功构建报告基因慢病毒p LVX-C9BC-Ac GFP1-N1和治疗基因慢病毒p LVX-C9BC-SOD2-T2A-Ac GFP1,经测序验证序列正确。病毒包装后测定滴度在5′108TU/ml以上,满足实验要求。嘌呤霉素药物筛选稳转细胞株,扩增培养后冻存备用。2.HT-29和CCD 841 Co N稳转细胞株实验表明,辐照诱导型嵌合启动子能在2Gy照射下有效启动下游基因的表达,照射处理后24h报告基因Ac GFP1和治疗基因SOD2表达量开始增加,至48h接近平台期。3.体外实验发现,含治疗基因的HT-29稳转株在6Gy辐照处理后,SOD2表达明显增高,细胞的增殖和生长较之于对照组明显受到抑制,凋亡比率增加。含治疗基因的CCD 841 Co N稳转细胞株在辐照处理后,SOD2表达明显增高,较之于对照组细胞增殖和生长受到较小抑制,凋亡比率相对较低。4.体内实验,成功建立HT-29 BALB/c裸鼠移植瘤模型,分组后给予慢病毒注射,72h进行6Gy局部照射处理。观察发现,较之于对照组荷瘤裸鼠,注射治疗基因慢病毒的裸鼠局部辐照后,肿瘤细胞内SOD2表达水平显著增高,肿瘤生长迟缓,凋亡细胞增多;注射治疗基因的皮肤组织凋亡细胞减少。结论由串联的CAr G盒和CMV基础启动子构成的嵌合型启动子具有明显的辐射诱导特性,在辐射处理下能有效启动下游基因的表达,并能在一定范围内根据辐射剂量对下游基因的表达进行调控。体内外实验证明,联合应用放疗及SOD2基因治疗,对肿瘤细胞具有放疗增敏效应,能有效抑制肿瘤细胞的增殖和生长;同时对正常细胞和组织有辐射保护作用,降低辐射野内正常细胞的凋亡率。
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本文编号：2105855