着丝粒蛋白-U（CENP-U）在乳腺癌增殖和转移中的调控作用及机制研究

发布时间：2018-07-08 12:50

本文选题：乳腺癌 + 着丝粒蛋白　；参考：《天津医科大学》2015年博士论文

【摘要】：背景:着丝粒蛋白-U(centromere protein U,CENP-U),作为重要的常驻性着丝粒结合蛋白之一,是动粒内层组成CCAN网络(constitutively centromere-associated network,CCAN)的重要原件之一,参与中期成熟动粒的组装,在细胞有丝分裂的过程中发挥了重要的作用。近年来的研究发现CENP-U表达情况与恶性肿瘤密切相关。本课题组拟通过体内、体外实验及临床病例资料研究阐明CENP-U在乳腺癌细胞增殖及转移中的作用和机制,丰富现有CENP-U基因功能的认识,为乳腺癌发生、发展的研究提供新的靶点。方法:1.利用免疫组化的方法分别检测乳腺导管内癌、乳腺癌及其配对癌旁组织中CENP-U蛋白的差异表达情况,同时比较转移组和未转移组患者间CENP-U不同表达情况;并进行CENP-U与浸润性导管癌患者预后的相关性分析。2.利用Western-blotting实验和免疫荧光实验检测正常乳腺上皮细胞及人乳腺癌细胞系中CENP-U蛋白的表达情况。3.构建沉默/过表达CENP-U稳转细胞系,绘制细胞的生长曲线,采用平板克隆、软琼脂克隆、免疫荧光等实验,观察沉默/过表达CENP-U表达对乳腺癌细胞和正常乳腺细胞的生物学行为的影响。4.利用流式细胞术,检测沉默/过表达CENP-U表达对细胞周期的影响,并检测凋亡细胞的比例;并利用Western-blotting实验检测其PI3K/AKT/NF-κB通路蛋白活性,以了解CENP-U对乳腺癌增殖能力的调节机制。5.构建沉默/过表达CENP-U细胞的体内移植瘤模型,检测改变CENP-U表达后对乳腺癌体内的生物学行为的影响。6.采用细胞划痕实验、Transwell实验,检测沉默/过表达CENP-U表达对乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力的影响;利用Western-blotting实验检测沉默/过表达CENP-U表达对EMT标志物表达的影响。7.利用Western-blotting实验检测乳腺癌非干细胞及干细胞中CENP-U的表达情况;利用流式细胞术检测CENP-U沉默/过表达细胞中ALDHhigh的比例。结果:1.通过对30例导管内癌及100例浸润性导管癌患者的组织进行CENP-U蛋白的免疫组化检测,发现:相较于癌旁组织,CENP-U蛋白在乳腺癌处于过表达的状态;转移组患者的CENP-U蛋白的阳性率也显著高于未转移组。在生存分析中发现:CENP-U蛋白表达阴性的浸润性导管癌患者的DFS和OS均显著优于CENP-U阳性的患者。2.细胞系中MCF-10A中CENP-U蛋白表达最低,MDA-MB-231表达最高,且在耐药细胞系中其蛋白表达量显著增加。3.沉默CENP-U对乳腺癌增殖能力的影响:绘制细胞的生长曲线发现,相较于sh-Control细胞,sh CENP-U细胞的生长能力受到了显著的抑制;且sh CENP-U的克隆形成能力显著下降。流式细胞术分析发现sh CENP-U细胞发生凋亡的比例和处于G2/M期的比例均显著增加;sh-CENP-U细胞的PI3K-p110α亚基、S6、NF-κB p65亚基的表达均下调,且AKT Ser473及S6 Ser235/236位点的磷酸化蛋白也显著下降。4.过表达CENP-U对乳腺癌及正常乳腺上皮细胞增殖能力的影响:无论是在T47D还是MCF-10A,p CDH-CENP-U细胞增殖和克隆形成能力均强于p CDH-Control细胞;且p CDH-CENP-U细胞中G2/M期比例显著增加,且PI3K-p110α亚基、NF-κB p65亚基的表达均上调,且AKT Ser473及S6Ser235/236位点的磷酸化蛋白显著上调。5.构建裸鼠移植瘤模型,对体内移植瘤体积进行检测发现:MDA-MB-231-sh CENP-U细胞的体内移植瘤显著小于对照组;而T47D-CENP-U细胞的移植瘤增长迅速。6.划痕和Transwell实验显示,相较于231-sh Control细胞,231-sh CENP-U细胞的迁移和侵袭能力下降,E-cadherin和β-catenin表达上调,Vimentin和N-cadherin表达下调;而T47D-CENP-U的迁移侵袭能力较其对照组显著增强,间质标志物表达上调,上皮标志物表达下调。7.相较于其对应的非干细胞群,乳腺癌干细胞中CENP-U表达均显著下降。利用干细胞分子标志物ALDH,检测了CENP-U过表达或沉默细胞系中乳腺癌ALDHhigh的比例,发现ALDHhigh细胞比例不受CENP-U表达情况影响。结论:1.临床数据显示:CENP-U蛋白表达与乳腺癌的发生及发展密切相关,且CENP-U蛋白表达有可能作为预测乳腺癌患者的预后指标。2.CENP-U在乳腺癌中可能发挥着促癌基因的作用,影响乳腺癌体内、体外的生长增殖能力。CENP-U可调控细胞周期、抑制凋亡、改变乳腺癌的PI3K/AKT/NF-κB信号通路活性,以调控乳腺癌细胞的生长增殖。3.过表达CENP-U表达通过诱导乳腺癌细胞EMT表型促进其迁移和侵袭能力;沉默CENP-U表达通过抑制EMT从而影响乳腺癌细胞迁移和侵袭。4.乳腺癌干细胞中CENP-U蛋白表达较低,CENP-U表达水平的改变对乳腺癌干细胞无影响。
[Abstract]:The expression of CENP - U protein in breast cancer cells and human breast cancer cells was investigated by Western - blotting . The results showed that the proliferation and invasion ability of CENP - U cells were significantly higher than those in control group .
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9

【共引文献】