叶酸偶联白蛋白cypate纳米粒的构建及靶向膀胱癌光热杀伤效应的实验研究

发布时间：2018-07-10 03:22

  本文选题：纳米技术 + 光热疗法　； 参考：《华中科技大学》2016年博士论文

【摘要】：目的：Cypate是具有光热转换效应的有机材料,可应用于肿瘤的光热治疗。本文构建了一种新型有机光热纳米材料叶酸偶联白蛋白Cypate(即FA-BSA-Cypate)纳米颗粒,由于叶酸和cypate能同时结合于血清白蛋白的不同位点而被血清白蛋白运输到体内,因肿瘤的EPR效应及叶酸与其受体的特异性结合而使膀胱肿瘤细胞更有效地摄取纳米粒中cypate,体外及体内实验证实Folate-BSA-Cypate纳米粒对膀胱肿瘤的靶向光热杀伤效应,探究其作用机制,有望为后期临床应用提供理论基础。方法：(1)合成有机材料Cypate并通过1H-NMR进行表征,溶剂透析法制备叶酸偶联白蛋白Cypate纳米颗粒,透射电子显微镜(TEM)对叶酸偶联白蛋白Cypate纳米颗粒的形态进行表征,动态光散射仪(DLS)测定纳米粒粒径分布,紫外分光光度法检测纳米粒载药量和包封率,观察不同浓度FA-BSA-Cypate纳米粒溶液(0、1、10、100μg/ml)在808nm激光(1.5W/cm2)照射下温度随时间变化,证实FA-BSA-Cypate纳米粒的光热升温效应。(2)免疫荧光法检测人膀胱癌5637细胞膜叶酸受体(FA-α receptor)的表达,紫外分光光度法测定5637细胞对FA-BSA-Cypate纳米粒、BSA-Cypate纳米粒的摄取量随时间变化,进一步应用激光共聚焦显微镜观察5637细胞对FA-BSA-Cypate纳米粒、BSA-Cypate纳米粒的摄取情况。(3)MTT法比较不同浓度FA-BSA-Cypate纳米粒细胞毒性,MTT法检测不同FA-BSA-Cypate纳米粒浓度、不同光照时间以及不同能量的808 nm的近红光照射所诱导的对5637细胞的光热杀伤效应。(4)DHE(Dihydroethidium)染色考察FA-BSA-Cypate纳米粒经激光照射后在细胞内单线态氧的水平；FA-BSA-Cypate纳米粒联合近红外光照射情况下,检测1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)消耗量以反映的单线态氧(102)的生成。(5)设定为激光功率密度为1.5W/cm2、波长为808 nm的激光照射5 min；将细胞分为四组：空白对照组、激光组、BSA-Cypate+激光组、FA-BSA-Cypate+激光组；流式细胞术检测各组细胞凋亡率；transwell法检测细胞的迁移能力;qRT-PCR和Western-blot法检测各组bcl-2、bax、 Caspase-3、Survivin、HSP70、HSP90mRNA和蛋白表达变化。(6)考察FA-BSA-Cypate纳米粒在膀胱癌5637细胞荷瘤小鼠体内的抗肿瘤活性,通过肿瘤体积增长、抑瘤率对光热抗肿瘤效果进行评价。结果：成功制备了具有良好光热升温特性的FA-BSA-Cypate纳米粒,其粒径为(101.2±9.3)nm、载药量为(45.8±3.3)%、包封率(91.5±4.2)%；808nm激光(1.5W/cm2,5min)照射下,纳米粒溶液最高温度可达59℃,且具有浓度依赖性；细胞免疫荧光证实人膀胱癌5637细胞膜表达叶酸受体(FA-a receptor);细胞摄取试验表明FA-BSA-Cypate纳米粒对膀胱癌5637细胞的靶向性；MTT显示不同浓度的FA-BSA-Cypate纳米粒作用于5637细胞24h后细胞存活率在95%以上,无明显生物毒性：联合808nm激光照射下,细胞存活率随着纳米粒浓度和激光能量密度的增加而下降,细胞存活率也随着激光照射时间的延长而下降；近红外光照条件下,FA-BSA-Cypate纳米粒能够促进单线态氧的生成,加重了细胞毒性；流式细胞检测结果显示FA-BSA-Cypate纳米粒组细胞凋亡率显著增高；transwell法检测结果表明FA-BSA-Cypate纳米粒组细胞的迁移能力显著下降；qRT-PCR及Western blot结果显不,FA-BSA-Cypate+激光组Bax、Caspase-3、Hsp70、Hsp90的表达显著增高,而BcL-2、Survivin的表达明显降低。808 nm激光照射(1.5 W/cm2)下,FA-BSA-Cypate纳米粒对5637细胞荷瘤裸鼠的皮下肿瘤生长具有显著的抑制作用。结论：有机纳米材料FA-BSA-Cypate纳米粒毒性低、肿瘤细胞靶向性强；体外及体内实验表明FA-BSA-Cypate纳米粒介导的靶向光热疗法对膀胱癌具有良好的靶向杀伤效果,能有效抑制5637细胞的增殖并促进其凋亡。本研究为将来临床应用基于FA-BSA-Cypate纳米粒的膀胱癌的靶向光热治疗奠定了一定的理论基础。
[Abstract]:Objective : Cypate was an organic material with photo - heat transfer effect . It was used in the photothermal treatment of tumor . The effect of folate - BSA - Cypate nanoparticles on the tumor of bladder cancer was measured by UV spectrophotometry . The effect of Folate - BSA - Cypate nanoparticles on bladder tumor was investigated . The effects of different concentrations of FA - BSA - Cypate nanoparticles were observed .
In the case of near - infrared irradiation , FA - BSA - Cypate nanoparticles were used to detect the consumption of 1,3 - diphenylisobenzofuran ( DPBF ) to reflect the generation of singlet oxygen ( 102 ) .
The cells were divided into four groups : blank control group , laser group , BSA - Cypate + laser group , FA - BSA - Cypate + laser group ;
Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of each group .
The expression of bcl - 2 , bax , Caspase - 3 , Survivin , HSP70 , HSP90mRNA and protein were detected by transwell method .
Under the irradiation of 808 nm laser ( 1.5W / cm ~ 2 , 5 min ) , the highest temperature of the nanoparticle solution can reach 59 鈩，

本文编号：2111840