Hedgehog与Wnt信号通路的调节作用在慢性淋巴细胞白血病中的机制研究及预后价值

发布时间：2018-07-21 10:16

【摘要】：研究背景及意义慢性淋巴细胞白血病是淋巴细胞克隆性增殖,浸润骨髓、外周血、淋巴结、肝脾及其他器官,最终导致正常造血功能衰竭的一种肿瘤性疾病。该病是欧美国家最常见的成人血液系统恶性肿瘤之一,近年来,随着对慢性淋巴细胞白血病的分子生物学研究不断深入,其诊断率逐年提高,目前,该病仍被认为是不可治愈的肿瘤性疾病,其具体的发病机制尚不明确。研究发现,多条信号通路相互交叉,构成体内复杂的信号通路网络,调控胚胎发育及恶性肿瘤的发生发展,因此,对于信号通路间交互作用的研究逐渐成为肿瘤治疗的前沿领域。已有研究证实EGFR、Notch、Hedgehog等信号通路均可与Wnt相互交叉共同参与调控肿瘤细胞的增殖和分化,如肺癌、乳腺癌、结肠癌和肝癌等实体肿瘤中都可观察到上述信号通路的表达失调。对于Hedgehog信号通路的研究已较为深入,Hedgehog通过PTCH和Smo发挥作用。正常情况下,PTCH与Smo结合处于失活状态。当Hedgehog通路激活后,Hh配体与PTCH结合并内吞,激活的Smo与Gli结合,促使Gli蛋白进入核内持续性激活,启动下游靶基因转录。Wnt信号通路主要通过3种途径进行传导,最主要的是经典Wnt信号途径,及Wnt/β-catenin信号通路,这条信号通路激活后将募集细胞质内的β-catenin转移入细胞核并启动靶基因转录,如c-myc、cyclinD1、COX-2、MMP等,因此,β-catenin的异常集聚及细胞核内定位是经典Wnt通路激活的重要标志,该信号通路的过度激活在恶性肿瘤的生长、增殖、转移中均有重要意义。研究证实,多种恶性肿瘤的发生发展与该通路的异常激活相关,尤其是上皮来源的恶性肿瘤,如肺癌、乳腺癌、胆囊癌等。在脊椎动物和非脊椎动物中,Wnt和Hedgehog信号通路的功能性拮抗也已得到证实。研究发现,Wnt和Hedgehog信号通路在视网膜神经前体细胞的增殖及两栖动物肢体再生中起相反作用。Hedgehog激活SFRP-1抑制β-catenin在细胞核内的集聚,从而抑制Wnt通路的活化。相反,β-catenin的异常集聚增强Gli3的活性,从而负反馈的抑制Hedgehog通路的过度激活。证实两者在信号传导过程中相互抑制,维持胚胎细胞增殖和分化过程的平衡。另外,Wnt信号通路可能作为Hedgehog的下游信号通路,在胃癌及宫颈癌患者中亦发现如上"串话"机制。最近的研究显示,Hedgehog通路阻滞剂有多种,如Cyclopamine、GANT-58及GANT-61等,其中GANT-61直接作用于Hedgehog通路的转录因子Gli1/2,特异性地阻滞Gli1/2介导的靶基因激活,从而抑制肿瘤细胞的增殖与分化。对信号通路交叉作用的研究能够更全面的揭示信号通路在肿瘤中的重要作用,克服单一信号通路研究的局限性,为恶性肿瘤的研究和治疗提供新的方向和靶点。为进一步探讨Hedgehog与Wnt信号通路的拮抗作用与慢性淋巴细胞白血病的关系,我们主要进行一下两方面的研究:①检测Hedgehog与Wnt信号通路的关键蛋白Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3在慢性淋巴细胞白血病患者中的表达情况,并进行预后相关性研究②对CLL细胞株MEC-1用不同浓度的GANT-61处理,检测处理前后细胞存活率及Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3的蛋白表达差异,探讨Hedgehog与Wnt信号通路的拮抗作用。第一部分Hedgehog与Wnt信号通路在慢性淋巴细胞白血病发病机制及预后中的相关性研究目的:检测Hedgehog与Wnt信号通路的关键蛋白Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3在慢性淋巴细胞白血病患者中的表达情况,探讨其与患者临床数据指标及预后的相关性。方法:收集自2010年12月21日至2015年10月31日在山东省立医院血液科住院治疗的CLL患者骨髓或外周血标本共43例,正常人外周血标本10例作为正常对照组。应用western blot检测Gli1、β-catenin、SFRP-1、Gli3的蛋白表达水平。采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析,患者临床病理资料与Gli1、β-catenin、SFRP-1、Gli3的蛋白表达水平采用Spearman相关分析,应用COX多因素回归模型进行预后因素分析,采用Kaplan-Meier法对患者进行生存分析,应用Logrank检验比较生存差别,从而探讨Hedgehog与Wnt信号通路的异常激活与慢性淋巴细胞白血病发病机制及预后的相关性。结果:CLL患者中Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3的表达水平均明显高于正常对照组(P0.05),差异具有统计学意义,证实在慢性淋巴细胞白血病患者中,Hedgehog及Wnt信号通路均为异常激活。应用COX多因素回归模型分析,Gli1、β-catenin、年龄、Rai临床分期、Benit临床分期与患者生存显著相关(P0.05),性别、LDH水平、β2微球蛋白、白细胞计数、B症状、SFRP-1、Gli3与生存率无明显相关性(P0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示,Gli1及β-catenin高表达的患者预后较差(P0.05),SFRP-1、Gli3高表达的患者与预后无明显相关性(P0.05)。结论:Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3 高表达提示 Hedgehog 与 Wnt 信号通路在慢性淋巴细白血病发病中具有重要意义,另外,Gli3的高表达提示Wnt信号通路的异常活化可能激活了 Hedgehog通路的负反馈抑制作用,抑制Hedgehog通路的进一步活化。Gli1及β-catenin高表达与患者预后不良密切相关。第二部分Hedgehog抑制Wnt信号通路对慢性淋巴细胞白血病细胞株(MEC-1)增殖活性的影响目的:①检测Hedgehog与Wnt信号通路的关键蛋白Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3在慢性淋巴细胞白血病细胞株(MEC-1)中的表达情况,探讨两条信号通路的激活在CLL细胞株中的表达情况。②对CLL细胞株MEC-1用不同浓度的GANT-61处理,检测处理前后细胞存活率及Gli1、SFRP-1、β-catenin、Gli3的蛋白表达情况,探讨Hedgehog与Wnt信号通路的拮抗作用。方法:应用 western blot 检测 MEC-1 中 Gli1、β-catenin、SFRP1、Gli3 的表达情况,探讨Hedgehog与Wnt信号通路在CLL细胞株中的表达情况。加入不同浓度的Gli1/2抑制剂GANT-61,采用CCK-8法检测不同剂量(10-150umol/L)、不同作用时间(24-72小时)对MEC-1的增殖抑制作用,应用流式细胞术检测细胞存活率。对比处理前后Gli1、β-catenin、SFRP1、Gli3的蛋白表达水平差异,初步探讨hedgehog抑制Wnt信号通路对MEC-1的增殖作用。结果:CLL细胞株中Gli1、β-catenin、SFRP-1、Gli3表达明显高于正常对照组(P0.05),差异具有统计学意义,证实Hedgehog及Wnt信号通路的异常激活在CLL细胞株MEC-1中的重要作用。GANT-61干预实验证实,GANT-61对MEC-1的增殖抑制作用具有时间-浓度依赖关系。Gli1的表达量在药物浓度50umol/L,作用时间24h时明显降低(P＜0.05)。SFRP1的表达量在浓度50umol/L,作用时间24h时明显降低(P0.05)。β-catenin的表达量在浓度50umol/L,作用时间24h时较前升高(P0.05)。Gli3的表达量在浓度50umol/L,作用时间24h时无明显变化(P0.05);增加药物浓度(100umol/L),不延长作用时间,不引起Gli3表达量的明显改变(P0.05);延长作用时间(48h)可引起Gli3表达量的进一步升高(P0.05)。结论:Gli1、SFRP-1、β-catenin、GH3 的高表达提示 Hedgehog 与 Wnt 信号通路在CLL细胞株(MEC-1)中的重要作用。Hedgehog作为Wnt信号通路的上游通路,通过抑制Wnt信号通路促进CLL细胞株MEC-1的增殖。GANT-61对MEC-1的增殖抑制作用具有时间-浓度依赖关系。另外,GANT-61抑制Hedgehog信号通路,通过上调β-catenin的表达,增强可Gli3的活性,提示Wnt信号通路的异常活化可能激活了 Hedgehog通路的负反馈抑制作用,抑制Hedgehog通路的进一步活化,提示两条信号通路间的"串话"机制。
[Abstract]:This disease is one of the most common malignant tumors in the adult blood system . In recent years , the study has shown that the signaling pathways of EGFR , Notch , Hedgehog and other signaling pathways can be used to regulate the proliferation and differentiation of tumor cells . In order to investigate the effects of Hedgehog and Wnt signaling pathway on the expression of Gli1 , SFRP - 1 , 尾 - catenin and Gli3 in the pathogenesis and prognosis of chronic lymphocytic leukemia . The expression of Gli1 , SFRP - 1 , 尾 - catenin and Gli3 in chronic lymphocytic leukemia cell line ( MEC - 1 ) was significantly correlated with the expression of Gli1 , SFRP - 1 , 尾 - catenin and Gli3 . The expression of Gli1 , 尾 - catenin , SFRP - 1 , Gli3 in the cell line MEC - 1 was significantly higher than that in the normal control group ( P0.05 ) .
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.72

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本文编号：2135200