【摘要】：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,主要发生于女性,偶见于男性。乳腺癌发病率在欧美等发达国家的女性恶性肿瘤中排第一位。乳腺癌在我国女性肿瘤发病率中亦高居榜首,并且发病率呈现逐年递增。全国肿瘤登记中心公布的2016年统计数据显示,我国的乳腺癌发病率近些年来明显增高,每年新发病例为27.3万,并且发病年龄越来越趋于年轻化。乳腺癌已经成为威胁女性身心健康、危害女性生命的头号杀手。近年来随着乳腺癌早期诊断水平和健康普查的不断提高,个体化治疗设计已成为目前乳腺癌主要的治疗策略,合理地综合应用手术、放疗、化疗、生物靶向治疗、内分泌治疗等多种治疗手段,使得乳腺癌患者的总体生存率有了明显提高。乳腺癌已经成为预后较好的实体瘤之一。肿瘤是由多因素、多步骤、多基因、多信号途径互相影响、互相作用的复杂生物学过程共同作用所形成的。乳腺癌的发病因素有多个,包括月经初潮年龄和绝经年龄、生育因素、哺乳情况、遗传、生活方式、内分泌状况,情绪、电离辐射等均与乳腺癌的发病有关。随着分子生物学、基因组学等科学技术的发展,多学科交叉后引发了从分子、基因等角度去探讨肿瘤的发生发展的热潮。microRNA (miRNA)是一类内源性的,短的非编码RNAs,能够通过与靶基因mRNA的3’-UTR的碱基互补配对来调节基因的表达,并导致靶mRNA的降解,或者直接介导mRNA的降解。除此之外,miRNA也能够在碱基与靶基因不完全配对时抑制翻译。miRNA对细胞的增殖、形态、凋亡和分化等方面扮演重要角色并且具有组织特异性的特点,另外它在肿瘤的演进过程中也起着重要作用。miRNA的异常表达通过调控靶基因的mRNA使其表达发生改变从而达到对肿瘤细胞的生物学行为的调控。miRNA调控基因表达成为肿瘤研究的新热点。现阶段研究者从肿瘤的靶向治疗和个体化治疗出发,进行多种尝试,并且已经取得一定成果。因此,寻找新的分子靶点对于乳腺癌患者的诊断和治疗以及改善预后都具有十分重要的意义。miRNA-205被发现了很长时间,但它的生物功能才刚刚开始被研究。研究显示miRNA-205的表达在许多肿瘤中是减少的,miRNA-205起到肿瘤抑制作用并参与许多生理和病理过程。miRNA功能研究的核心是miRNA靶基因的研究,明确miRNA如何通过调控靶基因,参与调节细胞的哪些生命活动,以及怎样影响细胞的生物学行为。故而,miRNA研究工作中的重点和难点一直是发现并明确miRNA调控的靶基因及所参与的信号通路。血管的生成在肿瘤的生长过程必不可少,并且在肿瘤的侵袭和转移阶段也发挥作用。Angiomotin(AMOT)是一种由675个残基组成的蛋白质,又称血管生成抑制素结合蛋白,顾名思义,是由一种膜相关蛋白与血管生成抑制素结合而形成。能够增加内皮细胞随机迁移以及内皮细胞趋向生长因子的迁移。AMOT在侵袭性肿瘤中的表达比非侵袭性肿瘤中显著增高,在乳腺癌发生转移的患者表达远高于未转移者。然而AMOT的上调机制尚不明确。miRNA-205在乳腺癌中的表达是显著下降的,有研究显示在乳腺癌中AMOT的表达是显著增高的,在表达量上两者之间呈负相关,所以我们选择miRNA-205来分析AMOT在乳腺癌中的角色。我们推测miRNA-205对AMOT的表达有调控作用。但目前尚无关于miRNA-205对AMOT的调控作用的报道,以及在人乳腺癌细胞中miRNA-205对AMOT作用机制的研究。本研究分三部分内容分别阐述miRNA-205与AMOT在乳腺癌的发生发展中可能作用以及其分子调控机制,为乳腺癌的诊断和治疗带来新的思路并且增强了我们对于AMOT转录后调节的认识。第一部分miRNA-205、AMOT在乳腺癌组织中的表达方法(1) 采用qRT-PCR技术检测20例乳腺癌组织标本和20例正常邻近组织标本中的miRNA-205的mRNA表达水平。(2) Real time PCR检测AMOT在乳腺癌组织和癌旁正常组织中的mRNA表达变化；Western Blot检测AMOT在乳腺癌组织和癌旁正常组织中的蛋白表达变化。(3) Real time PCR实验检测SKBR-3、MDA-MB-435S、MCF-7中miRNA-205的表达。(4)统计学处理：所有数据均应用SPSS18.0进行统计学处理,所有实验重复三次,计数资料比较采用χ2检验；计量资料采用x±s方式表达。组间比较采用单因素方差分析t-检验,P0.05有统计学意义。结果(1) miRNA-205在乳腺癌组织中的表达量及癌旁正常组织中的表达情况,结果显示,乳腺癌组织的表达(0.130±0.003)明显低于癌旁正常组织(1.004±0.048),(P0.05)差异有统计学意义。(2) Real time PCR法检测AMOT在肿瘤组织中的表达(4.027±0.158)与匹配的正常组织(1.228±0.050)相比显著上调,(P0.0001)差异有统计学意义。Western Blot在蛋白水平的表达说明AMOT在乳腺癌组织中高表达。(3) Real time PCR检测miRNA-205在不同的乳腺癌细胞株中的表达水平。以SKBR-3细胞株的miRNA-205的表达量为1,MDA-MB-435S的表达量为2.49±0.21,MCF-7的表达量为0.25±0.01,(P0.05)差异有统计学意义。MCF-7的表达量为最低,通过筛选,成为后续实验细胞株。第二部分miRNA-205对乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移能力的影响方法(1)采用脂质体Lipofectamine2000转染miRNA-205 mimics至乳腺癌细胞72h后,用RT-PCR法测定miRNA-205的表达情况。(2)CCK8实验检测转染miRNA-205 mimics后乳腺癌细胞MCF-70,12,24,48,96h生长曲线。(3)流式细胞术检测转染miRNA-205 mimics后乳腺癌细胞MCF-7细胞凋亡情况。(4) Transwell检测转染miRNA-205 mimics后乳腺癌细胞MCF-7细胞迁移实验。(5)转染miRNA-205 mimics以后分别以RT-PCR法和Western Blot检测AMOT的表达水平,明确miRNA-205过表达对AMOT的表达的影响。(6)所有数据应用GraphPad Prism6统计软件进行分析,每组实验进行3次,通过未配对独立样本t-检验或者单因素方差分析ANOVA,计数资料以x±s方式表达。P0.05,有统计学意义。结果(1)为了明确转染miRNA-205mimics后miRNA-205的表达变化情况,我们在转染后72h对miRNA-205进行了RT-PCR检测,以NC(阴性对照RNA)为对照组,以U6为内参。结果显示,miRNA-205的转染可显著上调miRNA-205的表达量(转染后的相对表达量是NC组的82倍)。P0.05,有统计学意义。(2)我们通过CCK-8法对miRNA-205mimics处理前后的乳腺癌细胞生长情况进行了检测。实验结果显示,随着观察时间的延长0,12,24,48,96h, mimics处理后的细胞生长明显下降,存在时间依赖效应。(3)用miRNA-205 mimic/NC处理后培养24小时,用Annexin V-FITC和PI染色后运用流式细胞检测术,进一步明确miRNA-205对MCF-7细胞株的凋亡无影响,P0.05,无统计学意义。(4) Transwell实验来检测肿瘤细胞的运动能力。细胞分组：mimic组和NC,用Transwell小室实验分别观察细胞迁移能力,实验结果显示miRNA-205过表达能显著抑制乳腺癌细胞的迁移能力o mimic组为(175.1±9.16),NC组为(238.5±11.20),P0.05,有统计学意义。(5)当miRNA-205通过mimic过表达后,AMOT在mRNA水平的表达没有受到明显影响,P0.05,无统计学意义。但在蛋白水平的表达较NC变为表达下降,P0.05,有统计学意义。第三部分miRNA-205的靶基因及影响乳腺癌的分子机制探讨方法(1)为了确定miRNA-205在乳腺癌中能够调节AMOT表达,我们应用预测软件TargetScan (www.targetscan.org)和miRDB (http://mirdb. org/miRDB)和MICRORNA (www.microrna.org)对miRNA-205靶基因预测数据库进行了分析。(2)构建质粒并验证,并将AMOT的3'UTR进行基因突变,实验分组NC+AMOT-3'UTR-WT; miR-205 mimics+AMOT-3'UTR-WT; NC+AMOT-3'UTR-MUT; miR-205 mimics+AMOT-3'UTR-MUT,以双荧光素酶实验验证AMOT是否是miRNA-205的靶基因。(3)采用脂质体Lipofectamine2000将siRNA或NC转染入乳腺癌细胞株MCF-7细胞,敲除AMOT后检测乳腺癌细胞的增殖、迁移能力以及对凋亡的影响。(4)采用脂质体Lipofectamine2000转染AMOT过表达质粒然后以Western Blot法检测AMOT的表达,实验分组为miRNA-205+AMOT-3'UTR-WT, miRNA-205+Vector(空质粒)。(5)共转染miRNA-205 mimics和AMOT过表达质粒与共转染miRNA-205和空质粒后进行CCK-8实验检测MCF-7的增殖、流式细胞仪检测细胞凋亡、Transwell实验检测细胞的迁移能力,进一步检测AMOT过表达后对MCF-7细胞生物学行为的影响并了解对miRNA-205过表达的影响。结果(1)运用生物信息学技术分析,根据互补配对原则,我们发现,AMOT基因3’-UTR在2938-2945有一个序列片段可能与miRNA-205结合。(2)通过PCR产物电泳、双酶切电泳及质粒测序鉴定并Blast比对,证明质粒构建成功,双荧光素酶报告系统验证AMOT是miRNA-205的靶基因,各组荧光素酶相对活性值分别为：NC+AMOT-3'UTR-WT(4.79±0.24); miR-205mimics +AMOT-3'UTR-WT (2.34±0.23); NC+AMOT-3'UTR-MUT (4.8±0.16); miR-205 mimics +AMOT-3'UTR-MUT (4.52±0.25),结果说明miRNA-205与AMOT-3'UTR-WT的作用位点能够结合(P0.05),有统计学意义。(3) siRNA干扰AMOT后Western blot检测发现AMOT的蛋白表达显著下降。通过CCK-8法对转染siRNA处理前后的乳腺癌细胞生长情况进行了检测。实验结果显示,随着观察时间的延长0,12,24,48,96h,siRNA处理后的细胞生长明显下降,存在时间依赖效应。流式细胞检测术siRNA干扰AMOT后同miRNA-205过表达一样对凋亡没有影响。Transwell检测乳腺癌细胞株MCF-7细胞的迁移能力,结果提示：MCF-7细胞的迁移能力显著下降,NC组为(238.5±11.20)；AMOT-siRNA组为(124.4±10.4),P0.05,有统计学意义。。(4) AMOT过表达实验进一步证实AMOT是miRNA-205的靶基因,共转染miRNA-205 mimics和AMOT过表达质粒或空质粒后以Western Blot检测AMOT在蛋白水平的表达,提示较对照组(空质粒)的AMOT表达水平显著提高,提示AMOT过表达可以逆转miRNA-205 mimics对AMOT表达抑制。(5) 共转染miRNA-205 mimics和AMOT过表达质粒后可以部分逆转miRNA-205对乳腺癌细胞株MCF-7细胞的增殖和迁移的抑制作用。结果显示MCF-7细胞株的生长抑制解除,且远超过对照组的细胞增殖,随着时间的延长而显著,在72h时这种解除效应达到最大,在72-96h之间处于平台期。细胞凋亡情况再次用流式细胞仪检测,结果显示无明显差异,P0.05。Transwell实验检测细胞的迁移能力,空质粒组为(136.1±13.8), AMOT过表达质粒组为(219.1士11.48)。差异有统计学意义,P0.05。共转染AMOT过表达质粒后,解除了miRNA-205过表达对乳腺癌细胞株MCF-7细胞迁移的抑制。结论1、miRNA-205在乳腺癌中的表达下调,AMOT在乳腺癌中的表达是显著增高的,二者的表达水平呈负相关。2、miRNA-205过表达能够抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移,但对凋亡无明显影响；miRNA-205过表达对AMOT在mRNA水平的表达无明显影响,但对蛋白水平的表达有抑制作用；3、AMOT是miRNA-205的直接靶基因,miRNA-205在乳腺癌细胞中通过作用于AMOT 3'-UTR特定位点来抑制其在蛋白水平的表达；AMOT过表达可以部分逆转miRNA-205过表达对乳腺癌细胞的增殖和侵袭的抑制作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
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本文编号：2145845
