Leptin诱导人乳腺癌细胞PKM2上调及对EMT影响的实验研究

发布时间：2018-08-12 08:38

【摘要】：目的探讨瘦素(Leptin)促人乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3的M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase,PKM2)表达及其诱导上皮间质化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的作用及机制,初步阐明Leptin通过上调糖代谢关键酶PKM2而影响乳腺癌EMT及其作用机制。方法1.采用蛋白质印记法(western blotting,WB)和免疫荧光法(immunofluorescence,IF)检测人乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-468中Leptin长受体OB-Rb、短受体OB-Rt的表达;采用人源Leptin处理三株细胞,观察细胞形态变化;WB检测细胞EMT相关标志蛋白的表达。2.Leptin处理人乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3后,采用QRT-PCR和WB,分析PKM2 m RNA及蛋白水平的变化。3.采用化学合成的PKM2-si RNA干扰乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3的PKM2,划痕及Transwell侵袭实验分别检测Leptin对两株细胞迁移及侵袭能力的影响;WB检测Leptin对两株细胞EMT相关标志蛋白表达的影响。4.采用Leptin联合PI3K/AKT、JAK/STAT、MAPK/ERK1/2信号通路抑制剂处理乳腺癌细胞MCF-7和SK-BR-3,WB检测PKM2的表达。采用Leptin受体中和抗体处理乳腺癌细胞MCF-7和SK-BR-3后,WB检测Leptin对PKM2表达及对PI3K/AKT信号通路激活的影响;采用WB检测PI3K/AKT通路抑制剂处理后,乳腺癌细胞MCF-7和SK-BR-3中PKM2及EMT相关蛋白的表达。5.构建稳定干扰PKM2的乳腺癌SK-BR-3细胞株,利用该细胞株建立裸鼠移植瘤模型,测量肿瘤大小,观察裸鼠生存期。免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测肿瘤组织EMT相关蛋白的表达,HE染色检测肿瘤肝肺转移。结果1.WB及IF结果表明,乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3和MDA-MB-468均表达OB-Rb和OB-Rt;Leptin能引起三株细胞形态发生EMT样改变,且下调上皮性标志物E-cadherin,上调间质性标志物Vimentin和Fibronectin的表达。2.QRT-PCR及WB结果显示,Leptin能显著上调MCF-7、SK-BR-3细胞PKM2的m RNA及蛋白水平。3.为进一步探讨PKM2在Leptin促乳腺癌细胞EMT过程中的作用,采用PKM2-si RNA干扰细胞表达PKM2,划痕及Transwell实验结果表明,MCF-7、SK-BR-3细胞的迁移和侵袭能力被抑制;WB检测提示,细胞的E-cadherin水平升高,Vimentin、Fibronectin水平降低,即干扰细胞PKM2表达后Leptin促EMT作用被抑制。4.WB结果表明,抑制PI3K/AKT信号通路能减弱Leptin促PKM2表达的作用。采用中和性抗体封闭Leptin受体OBR,PI3K/AKT信号通路的激活被抑制,Leptin促PKM2表达的作用也被抑制。采用WB检测发现PI3K/AKT信号通路抑制后,Leptin促乳腺癌细胞PKM2表达及EMT的作用被抑制。5.裸鼠乳腺癌移植瘤模型分为SKBR-3、SKBR-3-LV和SKBR-3-sh PKM2组,其中SKBR-3、SKBR-3-LV为对照组,SKBR-3-sh PKM2为实验组。实验结果表明SKBR-3-sh PKM2组肿瘤体积、重量均明显小于对照组。HE染色SKBR-3、SKBR-3-LV组肝肺转移灶较SKBR-3-sh PKM2组明显增多。瘤组织IHC结果显示,与对照组相比,SKBR-3-sh PKM2组E-cadherin表达明显升高,Vimentin、Fibronectin表达明显降低,SKBR-3-sh PKM2组小鼠生存期明显延长。结论1.Leptin促进乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-468发生EMT。2.Leptin激活PI3K/AKT信号通路上调乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3的PKM2表达,进而促进乳腺癌细胞发生EMT。3.抑制PKM2能够减弱乳腺癌细胞移植瘤的生长,延长荷瘤小鼠生存期,减少乳腺癌肝肺转移,PKM2可能是影响乳腺癌侵袭转移的重要靶点。
[Abstract]:Objective To investigate the effect and mechanism of leptin on the expression of M2-pyruvate kinase (PKM2) and epithelial-mesenchymal transition (EMT) in human breast cancer cells MCF-7, SK-BR-3. Methods 1. Western blotting (WB) and immunofluorescence (IF) were used to detect the expression of Leptin long receptor OB-Rb and short receptor OB-Rt in MCF-7, SK-BR-3 and MDA-MB-468 breast cancer cells. The morphological changes of three cells were observed by human Leptin treatment. The expression of EMT-related marker protein was detected by WB. After treatment of human breast cancer cells MCF-7, SK-BR-3, the changes of PKM2 m RNA and protein levels were analyzed by QRT-PCR and WB. 3. The effects of Leptin on the migration and invasion of breast cancer cells MCF-7, SK-BR-3 were detected by interfering with PKM2, scratch and Transwell invasion assays with chemically synthesized PKM2-si RNA, and WB was used to detect the effects of Leptin on the migration and invasion of the cells. Leptin combined with PI3K/AKT, JAK/STAT, MAPK/ERK1/2 signal pathway inhibitors were used to treat breast cancer cells MCF-7 and SK-BR-3. WB was used to detect the expression of PKM2. Leptin receptor neutralizing antibodies were used to treat breast cancer cells MCF-7 and SK-BR-3. WB was used to detect the expression of PKM2 and activation of PI3K/AKT signaling pathway. The expression of PKM2 and EMT-related proteins in breast cancer cells MCF-7 and SK-BR-3 after treatment with PI3K/AKT pathway inhibitors was detected by WB. 5. The SK-BR-3 cell line stably interfering with PKM2 was constructed. The nude mice transplanted tumor model was established by using this cell line, the tumor size was measured and the survival time was observed. Results WB and IF results showed that breast cancer cells MCF-7, SK-BR-3 and MDA-MB-468 all expressed OB-Rb and OB-Rt; Leptin could induce EMcadT-like changes in three cell lines, and down-regulate the epithelial marker E-cadherin and up-regulate the interstitial marker Vimenti Vimenti. QRT-PCR and WB results showed that Leptin could significantly up-regulate the expression of M RNA and protein of PKM2 in MCF-7, SK-BR-3 cells. 3. To further explore the role of PKM2 in the process of Leptin promoting EMT in breast cancer cells, PKM2-si RNA was used to interfere with the expression of PKM2 in cells. Scratch and Transwell experiments showed that MCF-7, SK-BR-3 cells migrated. WB assay showed that E-cadherin level increased, Vimentin and Fibronectin levels decreased, that is, Leptin-induced EMT was inhibited after interfering with PKM2 expression. 4. WB assay showed that inhibition of PI3K/AKT signaling pathway could attenuate Leptin-induced PKM2 expression. The activation of the pathway was inhibited and the effect of Leptin on PKM2 expression was inhibited. WB assay showed that the effect of Leptin on PKM2 expression and EMT in breast cancer cells was inhibited after PI3K/AKT signaling pathway was inhibited. 5. Nude mice breast cancer xenograft models were divided into SKBR-3, SKBR-3-LV and SKBR-3-sh PKM2 groups, SKBR-3-LV as control group, SKBR-3-sh PKM2 as control group. The results showed that the tumor volume and weight of SKBR-3-sh PKM2 group were significantly smaller than those of control group. The liver and lung metastases of SKBR-3, SKBR-3-LV group were significantly more than those of SKBR-3-sh PKM2 group. The survival time of R-3-sh PKM2 group mice was significantly prolonged. Conclusion 1. Leptin can promote the occurrence of EMT in breast cancer cells MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-468. Leptin can activate PI3K/AKT signaling pathway and up-regulate the expression of PKM2 in breast cancer cells MCF-7, SK-BR-3, thereby promoting the occurrence of EMT.3 in breast cancer cells. PKM2 may be an important target for breast cancer invasion and metastasis.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

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本文编号：2178526