转染CD137L的人脐血树突细胞对结直肠癌患者自然杀伤细胞体外扩增及功能影响的实验研究

发布时间：2018-08-12 17:09

【摘要】：第一部分不同处理作用后树突细胞对志愿者外周血免疫细胞体外扩增及功能影响的实验研究目的:通过密度梯度离心法分离获取志愿者外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)及脐带血单个核细胞(Mononuclear Cells,MNCs),观察经不同处理作用后树突细胞(Dendritic cells,DCs)细胞表型表达差异,和其对志愿者外周血PBMCs体外扩增、分化的刺激促进能力,以及增殖后的免疫效应细胞对肿瘤靶细胞杀伤效率的差异;方法:1采用密度梯度离心法经志愿者外周血及脐带血离心分离获取PBMCs及MNCs,利用贴壁法纯化获取DCs并单独培养;2利用人结肠癌细胞株SW-1116作为靶细胞提取肿瘤特异性抗原(Tumor Special Antigen,TSA)并对外周血树突细胞(Peripheral Dendritic cells,pDCs)及脐血来源树突细胞(Umbilical Dendritic cells,uDCs)进行负载活化;3不同处理后的DCs与PBMCs进行体外混合培养扩增,利用流式细胞仪、酶联免疫法及淋巴细胞毒性杀伤实验观察不同处理组DCs细胞表型和增殖扩增后的PBMCs细胞含量及种类的差异,以及培养上清中细胞因子γ干扰素(IFN-γ)的含量和对靶细胞杀伤能力的差异。结果:1不同处理组的DCs表型变化及抗原提呈能力差异:经TSA负载后的pDCs其CD83细胞表型较培养前(12.26±3.78)%明显增高(55.69±5.24)%,表达差异有统计学意义(t=7.87,P=0.01);CD86的表达较培养前(35.71±4.44)%有明显增高(87.99±4.94)%,表达差异有统计学意义(t=7.65,P=0.02)。经TSA负载后的uDCs其CD83细胞表型较培养前(13.79±2.18)%有所增高(31.65±8.01)%,但表达差异无统计学意义(t=2.15,P=0.10);CD86的表达较培养前(20.73±5.27)%有所增高(58.81±13.88)%,表达差异也无统计学意义(t=2.56,p=0.06)。2不同处理组dcs对pbmcs体外扩增的影响差异:负载tsa后的pdcs对pbmcs体外扩增有明显促进作用,扩增后的pbmcs中含有cd3+cd8+t(40.22±1.13)%、cd3+cd4+t(36.68±0.55)%及cd3-cd56+nk(42.45±1.49)%等混合细胞;未负载tsa的pdcs对pbmcs体外扩增也有一定促进作用,扩增后的pbmcs中含有cd3+cd4+t(46.93±1.01)%、cd3-cd56+nk(37.39±2.04)%和cd3+cd8+t(24.88±0.55)%等混合细胞,其中cd3+cd8+t含量较负载tsa后的pdcs组明显下降(f=242.01,p0.01);无pdcs的pbmcs体外培养后也有扩增,扩增后的pbmcs中含有cd3+cd4+t(53.18±2.16)%、cd3-cd56+nk(26.14±0.99)%及cd3+cd8+t(11.51±0.30)%等混合细胞,其中cd3+cd4+t含量较其他组明显升高而cd3+cd8+t含量较其他组明显降低(f=83.99,p0.01);负载tsa后的udcs对pbmcs体外扩增有较强地促进作用,扩增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk(61.98±0.67)%、cd3+cd8+t(29.57±0.67)%和cd3+cd4+t(33.57±0.97)%等混合细胞,其中cd3-cd56+nk含量较其他组明显增高(f=246.97,p0.01);未负载tsa的udcs对pbmcs体外扩增有一定促进作用,扩增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk(62.08±1.79)%、cd3+cd8+t(20.12±0.55)%和cd3+cd4+t(54.71±0.68)%等混合细胞,其中cd3-cd56+nk含量与负载tsa后的udcs相似;3不同处理组dcs对pbmcs细胞培养上清ifn-γ含量的影响差异:负载tsa后的pdcs混合pbmcs培养组上清内ifn-γ含量为(11.64±0.91)pg/ml,随着培养时间的延长增高至(63.03±1.69)pg/ml,培养前后差异有明显统计学意义(t=19.76,p=0.03);未负载tsa的pdcs混合pbmcs培养组上清内ifn-γ含量较负载tsa的pdcs组低(10.92±0.89)pg/ml,随着培养时间的延长其含量为(20.26±0.43)pg/ml,培养前后差异无统计学意义(t=7.08,p=0.09);无pdcs混合pbmcs培养组上清内ifn-γ含量为(10.04±0.69)pg/ml,且随着培养时间的延长变化不明显(15.11±1.79)pg/ml,培养前后差异无统计学意义(t=4.61,p=0.14);负载tsa的udcs混合pbmcs培养组上清内ifn-γ含量为(11.46±1.09)pg/ml,随着培养时间的延长有增高趋势(48.17±4.49)pg/ml,但培养前后差异无明显统计学意义(t=6.58,p=0.09);未负载tsa的udcs混合pbmcs培养组培养上清ifn-γ含量(11.63±0.55)pg/ml及变化趋势(29.55±2.26)pg/ml与负载tsa的udcs混合pbmcs培养组含量相似(t=10.46,p=0.06);4不同处理组dcs混合pbmcs培养后免疫效应细胞对结肠癌靶细胞sw-1116的杀伤效率差异:负载tsa的pdcs刺激扩增1周后的pbmcs对结肠癌靶细胞sw-1116的杀伤效率最高(63.93±0.75)%,具有很强的特异性杀伤能力(t=2.99,p=0.04);未负载tsa的pdcs刺激扩增1周后pbmcs对结肠癌sw-1116靶细胞有一定杀伤效率(30.91±0.03)%,但无明显特异性杀伤能力(t=0.58,p=0.59);无pdcs存在的pbmcs扩增1周后对结肠癌sw-1116靶细胞也有杀伤效果(10.78±0.02)%,其杀伤效率低且无明显特异性(t=0.69,p=0.53);负载tsa的udcs刺激扩增1周后pbmcs对结肠癌靶细胞sw-1116有一定杀伤效率(39.84±0.02)%,但其特异性杀伤能力不明显(t=0.66,p=0.99);未负载tsa的udcs刺激扩增1周后pbmcs对结肠癌靶细胞sw-1116的杀伤效果(22.83±0.09)%与负载tsa的udcs组相同,也无明显特异性杀伤能力(t=0.05,p=0.97)。第二部分转染cd137l脐血树突细胞对志愿者外周血免疫细胞体外扩增及功能影响的实验研究目的:通过构建cd137l/pegfp-n1质粒,利用脂质体法将质粒转染体外分离培养的udcs得到成功转染后的工程udcs(transfectumbilicaldendriticcells,tudcs),观察tudcs细胞表型变化及其对外周血pbmcs体外扩增及免疫功能的影响;方法:1通过基因库查询获取cd137l基因的核心序列,针对cd137l基因cds区域设计并合成引物,其引物序列中添加利于质粒构建的限制性内切酶xho1及ecor1酶切位点序列;2利用pcr技术以目的基因引物为模板进行扩增,扩增产物经电泳鉴定后,利用胶切回收技术回收扩增后的目的基因扩增产物;3以pegfp-n1质粒作为表达载体,利用引物设计中的限制性内切酶酶切位点将扩增引物与表达载体质粒连接,并将带有目的基因的质粒经dh5α感受态细胞转化后扩增,同时经克隆pcr鉴定及阳性质粒抽提,获取目的质粒,并送测序鉴定质粒中目的基因的表达;4经测序鉴定后的含有cd137l目的基因的pegfp-n1表达质粒(cd137l/pegfp-n1),利用无更换培养基的polodeliver3000转染剂将cd137l/pegfp-n1加入udcs中混合培养,通过荧光显微镜观察转染成功后tudcs表面荧光蛋白表达情况,通过流式细胞仪观察tudcs表面cd137l表达情况;5将tudcs与pbmcs体外混合培养,利用流式细胞仪、酶联免疫法及淋巴细胞毒性杀伤实验观察tudcs细胞表型和增殖扩增后的pbmcs细胞含量及种类的差异,以及培养上清中细胞因子ifn-γ的含量和对靶细胞杀伤能力的差异。结果:1成功构建的cd137l/pegfp-n1质粒能够顺利转染udcs并使其成功表达cd137l(31.65±0.23)%;2培养后tudcs其cd83细胞表型较培养前(10.23±0.68)%明显增高(73.96±3.69)%,表达差异与未转染组比较有明显统计学意义(t=14.02,p0.01);细胞表型cd86较培养前(11.37±0.38)%有明显增高(91.02±6.80)%,表达差异与未转染组比较有明显统计学意义(t=10.69,p0.01);3tudcs对pbmcs体外扩增有明显促进作用;扩增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk(92.79±1.59)%、cd3+cd4+t(47.25±1.05)%和cd3+cd8+t(21.64±1.99)%等细胞,cd3-cd56+nk细胞含量与未转染组比较明显增多(f=113.89,p0.01);4tudcs混合pbmcs培养组上清ifn-γ含量检测为(11.81±0.01)pg/ml,随着培养时间的延长增高至(57.04±1.74)pg/ml,与未转染组比较差异有明显统计学意义(p=0.01);5tudcs刺激扩增1周后的pbmcs(cd3-cd56+nk)对结肠癌特异性靶细胞sw-1116有明显的杀伤效率(51.52±0.05)%,其杀伤效率与负载tsa的udcs组(41.07±0.01)%相比无明显统计学差异(p=0.09),而明显高于空转对照组(ctudcs)(31.29±0.04)%和未负载tsa的udcs组(31.01±0.01)%,组间差异比较有明显统计学意义(p0.01);tudcs混合培养1周后的pbmcs(cd3-cd56+nk)对结肠癌非特异性靶细胞ls-174-t同样有明显的杀伤效率(53.26±0.02)%,其杀伤效率明显高于负载tsa的udcs组(38.32±0.02)%、ctudcs组(31.94±0.05)%和未负载tsa的udcs组(29.69±0.01)%,组间差异比较有明显统计学意义(f=6.88,p=0.01);针对特异性靶细胞sw-1116和非特异性靶细胞ls-174-t,ctudcs组杀伤率无明显差异(t=0.32,p=0.76)。第三部分转染cd137l脐血树突细胞对结直肠癌患者外周血自然杀伤细胞体外扩增及功能影响的实验研究目的:采用密度梯度离心方法获取结直肠癌患者外周血pbmcs及脐带血mncs,采用贴壁法获取udcs和肿瘤患者外周血dcs(tumorperipheraldendriticcell,tpdcs);通过转染及抗原负载对udcs进行分组处理后使其分别与结直肠癌患者外周血pbmcs共培养,观察体外培养过程中不同处理组dcs对结直肠癌患者外周血pbmcs体外扩增、免疫功能恢复及免疫杀伤能力变化的影响差异。方法:1采用密度梯度离心的方法获取结直肠癌患者外周血pbmcs及脐带血mncs,通过贴壁法获取肿瘤患者外周血tpdcs,分别进行体外培养;2利用polodeliver3000转染剂将构建成功的cd137l/pegfp-n1质粒、pegfp-n1质粒分别转染至udcs细胞内即转染组(tudcs)和空转对照组(ctudcs)。将靶细胞sw-1116的ag负载tpdcs作为阳性对照组(tpdcs),将不同处理组dcs与患者外周血pbmcs混合培养,利用流式细胞术、酶联免疫吸附及淋巴细胞毒性杀伤实验观察其体外扩增能力、细胞分群、培养上清ifn-γ含量以及免疫效应细胞对肿瘤靶细胞杀伤效率的差异。结果:1tudcs对结直肠癌患者外周血pbmcs体外扩增有明显促进作用,扩增后的pbmcs中含有cd3-cd56+nk(91.63±0.49)%、cd3+cd4+t(9.15±4.65)%和cd3+cd8+t(19.15±0.60)%等细胞,其中cd3-cd56+nk含量明显增高,与其他组间差异有统计学意义(p0.01);2tudcs混合培养的pbmcs组上清ifn-γ含量为(57.05±0.87)pg/ml与培养前(9.69±0.34)pg/ml差异比较有统计学意义(t=50.78,p0.01),tudcs组上清ifn-γ含量与ctudcs组(18.35±2.63)pg/ml和tpdcs组(47.98±0.67)pg/ml比较,组间差异明显(f=151.36,p0.01);3tudcs刺激扩增1周后的pbmcs(cd3-cd56+nk)对人结肠癌特异性靶细胞sw-1116(52.87±0.02)%和非特异性靶细胞ls-174-t(53.61±0.01)%都具有明显的杀伤效率。ctudcs组对靶细胞sw-1116(29.16±0.07)%和ls-174-t(30.91±0.07)%的杀伤率低于tudcs组,差异比较有明显统计学意义(p0.01);tudcs组对特异性靶细胞sw-1116杀伤率与tpdcs组比较,杀伤效率差异无明显统计学意义(p=0.46);tudcs组对非特异性靶细胞ls-174-t杀伤率高于tpdcs组(37.91±0.01)%,组间差异比较有统计学意义(p=0.03);tudcs诱导扩增的肿瘤患者外周血cd3-cd56+nk对人结肠癌靶细胞sw-1116及ls-174-t细胞杀伤无靶细胞特异性(p=0.27)。第四部分转染cd137l脐血树突细胞激活的志愿者外周血自然杀伤细胞对荷瘤裸鼠的体内抗瘤作用影响的实验研究目的:选择scid/beige裸鼠作为研究对象,以人结肠癌sw-1116作为肿瘤细胞在裸鼠腋侧皮下接种移植瘤后构建人结肠癌肿瘤模型;通过鼠尾静脉回输人外周血pbmcs细胞模拟重建人源化免疫环境状态;荷瘤后裸鼠明确腋下移植瘤移植成功,通过鼠尾静脉回输不同处理组活化扩增后的志愿者外周血免疫效应细胞,观察荷瘤裸鼠的生活习性改变及生存时间,并记录肿瘤体积、裸鼠体重、离体瘤重及裸鼠肝脾脏器重量等数据指标,从而评估免疫细胞在荷瘤裸鼠体内的抗肿瘤作用。方法:1培养扩增人结肠癌细胞株sw-1116细胞,收集生长对数期细胞作为移植瘤接种细胞;2选取5×105/0.5mlsw-1116细胞接种于裸鼠腋窝皮下处构建人结肠癌动物模型;选取1×106/0.5ml人pbmcs细胞经鼠尾静脉回输构建人源化免疫环境;观察空白对照组(blank)、人源化对照组(cpbmcs)、抗原负载组(pdcs)和转染组(tudcs)裸鼠,确定各组裸鼠移植瘤成瘤时间及瘤体体积大小的差异;3明确成瘤后实验组及阳性对照组经鼠尾静脉给予不同免疫效应细胞回输,观察不同处理组荷瘤小鼠生活习性改变及生存时间情况,记录各组荷瘤裸鼠瘤体体积变化、裸鼠体重变化、裸鼠瘤体离体重量以及肝脾脏器重量,通过计算不同观察指标从而评价免疫效应细胞在荷瘤裸鼠体内对移植瘤的抑制作用效果的差别。结果:1接种人结肠癌细胞株sw-1116细胞的各组裸鼠成瘤时间分别为blank组(4.71±0.18)ds、cpbmcs组(7.71±0.29)ds、pdcs组(7.86±0.26)ds和tudcs组(8.14±0.69)ds,blank组成瘤时间与其他三组比较,组间差异有统计学意义(f=40.96,p0.01);2cpbmcs组裸鼠成瘤体积(201.43±69.84)mm3低于blank组(436.04±54.50)mm3,差异比较有明显统计学意义(t=4.02,p0.01);cpbmcs组裸鼠离体瘤重(1.25±0.12)g低于blank组(2.83±0.24)g,差异比较有明显统计学意义(t=5.83,p0.01);离体肿瘤免疫组织化学染色观察可见明显cd3+cd4+t及cd3+cd8+t免疫细胞在肿瘤组织周围浸润;3 tuDCs组荷瘤裸鼠瘤体体积均值(92.11±11.55)mm3明显低于Blank组(t=6.17,P0.01)和cPBMCs组(t=3.79,P0.01),差异比较有明显统计学意义;tuDCs组荷瘤裸鼠离体瘤重均值(0.66±0.07)g明显低于Blank组(t=8.57,P0.01)和cPBMCs组(t=4.21,P0.01),差异比较有明显统计学意义;tuDCs组与pDCs组荷瘤裸鼠瘤体体积(85.61±11.59)mm3(t=0.39,P=0.69)及离体瘤重均值(0.63±0.09)g(t=0.33,P=0.75)比较,差异无明显统计学意义。结论:1在IL2、IL-15共同存在的体外培养环境下,脐血树突细胞能够促进外周血PBMCs体外扩增,并可诱导细胞向CD3-CD56+NK细胞方向转化且具备有较强的免疫杀伤功能;2利用PoloDeliver 3000转染剂能够将构建的CD137L/pEGFP-N1质粒成功转染脐血树突细胞并使其表面瞬时表达CD137L;3转染CD137L/pEGFP-N1的脐血树突细胞对外周血PBMCs体外培养扩增有明显的促进作用,可诱导其转化产生大量具有杀伤活性的CD3-CD56+NK细胞;4转染CD137L/pEGFP-N1脐血树突细胞可改善结直肠癌患者外周血PBMC免疫细胞的抑制状态,诱导并增强CD3-CD56+NK细胞数量及其免疫杀伤功能;5转染CD137L/pEGFP-N1脐血树突细胞诱导生成的CD3-CD56+NK细胞在体内体外均对肿瘤细胞有明显的杀伤效应,可作为重要的临床免疫治疗细胞在肿瘤的预防、术后复发等方面为肿瘤临床免疫治疗方式提供新的策略。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34

【参考文献】