EPAS1和miR-200a调控非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药性的机制研究

发布时间：2018-08-19 07:05

【摘要】：第一部分EPAS1通过EGFR和MET信号通路调控非小细胞肺癌TKI耐药性目的:肺癌已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第1位的恶性肿瘤。非小细胞肺癌包括常见的鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等,与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%,其中约75%的患者发现时已处于中晚期,5年生存率很低。近年来随着药物基因组学的开展,非小细胞肺癌的药物相关研究大幅度提升,一方面,为更好地发挥化疗效应起到指导作用;另一方面越来越多的靶向药物被研制出来,在肿瘤治疗方面起到了许多令人鼓舞的成果。在肺癌的靶向治疗、转移因素、耐药性方面我们做了许多探索。目前针对第一代靶向治疗药物EGFR-TKI,以吉非替尼和厄洛替尼为代表,对于初治的非小细胞肺癌患者,中位PFS可达10个月,随之而来的耐药性函待解决。因此相关领域一些新的蛋白基因受体研究异常火热。本研究旨在探究是否有其他因子参与了EGFR与MET的调控,我们对全基因组中HIF-1α的类似物进行了筛查。其家族成员EPAS1在EGFR调控MET中的作用我们进行了系统研究,我们将HA标记的EPAS1(HA-EPAS1)与Myc标记的EGFR(Myc-EGFR)共同转染至HCC827细胞中,并使用HA的抗体进行免疫共沉淀实验。以确认这种结合是否具有细胞特异性,同时我们在A549中进行了相同的实验。为了进一步探究EPAS1和T790M EGFR的结合是否为直接结合,我们使用了DTME作为交联剂进行蛋白交联实验。再者,为了研究MET信号通路是否受EPAS1与T790M EGFR的相互作用影响,我们在HCC827细胞系中同时分别过表达EPAS1、野生型EGFR以及T790M EGFR,并检测MET的表达量。关于EPAS1与T790M EGFR是否依赖于配体,我们构建了配体结合域缺失的载体ΔN-T790M,并将其与EPAS1共同转染至HCC827细胞中。为了探究EPAS1与T790M EGFR的相互作用对NSCLC药物耐受的作用,我们将EPAS1与T790M EGFR共同转染至HCC827细胞中以EPAS1载体的空载作为对照,并使用吉非替尼和埃罗替尼处理细胞,用克隆实验检测分别共转染EASP1与T790M EGFR以及野生型EGFR对NSCLC对TKI处理的药物抵抗作用。最后为了探究EPAS1与T790M EGFR的相互作用是否通过MET信号通路来发挥作用的,我们敲低了内源的MET的表达并检测了细胞增殖和生长情况。方法:细胞培养NSCLC细胞系HCC827和A549购自美国ATCC(马纳萨斯)并且从收到细胞到完成文章不超过六个月时间。细胞用含10%胎牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,2 m M-左旋谷酰胺的DMEM培养基培养,同时将细胞放入37℃含5%CO2的恒温培养箱中培养。质粒构建将EPAS1编码序列克隆到N端含HA标签的p CMV-HA质粒中,同时将配体结合域确实的突变型EGFR(氨基酸2-620)克隆到N端含Myc标签的pc DNA3.1质粒中。免疫荧光将HCC817转染HA-标记的EPAS1质粒并将细胞培养在细胞培养小室中,检测时用4%甲醛固定三十分钟,接着使用0.2%Triton X-100破膜5分钟,使用5%BSA进行封闭。使用鼠源的抗HA的一抗室温孵育并使用Alexa Fluor 488羊抗鼠荧光二抗室温孵育30分钟后使用DAPI作为DNA染料。在抗体孵育后,细胞用PBS清洗并用抗荧光猝灭封片剂进行封片。免疫沉淀和蛋白免疫印迹蛋白裂解使用RIPA裂解液,配方为50 m M Tris-HCl,p H 7.4,150 m M Na Cl,1 m M EDTA,1%Triton X-100,1%脱氧胆酸钠,0.1%SDS并添加蛋白抑制剂。将裂解完的细胞用4℃的冰冻离心机12000rpm/min离心10min,将上清与琼脂糖球体以及抗HA和抗Myc的抗体4℃共同孵育2h。将孵育后的琼脂糖珠用裂解液清洗三遍后用最终洗脱液(50 m M Tris,p H 7.5,and 50 m M Na Cl)清洗两遍。将琼脂糖朱用SDS-PAGE上样缓冲液洗脱下来并95℃热变性5min,使用SDA-PAGE胶进行蛋白分离并用转膜仪将蛋白转移到PVDF膜上。将转好的膜用PBST(PBS,0.1%Tween-20)溶解的含5%脱脂奶粉的封闭液进行封闭2h,并在4℃孵育一抗过夜。在用PBST清洗后,用含辣根过氧化酶的二抗进行孵育2h后再用PBST清洗后进行爆片。蛋白交联实验将HCC827细胞共转染EPAS1和野生型或突变型T790M EGFR后收集细胞并在4℃冰冻离心机中800g离心10 min并用PBS重悬。将交联剂用DMSO溶解后备用并将其加入到细胞悬液中使终浓度为0.1m M,在4℃孵育2 h。使用RIPA裂解液进行理解并进行蛋白免疫沉淀反应。蛋白使用添加DTT或未添加DTT的SDS-PAGE上样缓冲液进行洗脱并进行蛋白免疫印迹。RNA干扰和荧光定量PCR为了进行RNA干扰实验,靶向MET的慢病毒载体sh RNA V2LHS_113750和V3LHS_318637购自GE Dharmacon公司。细胞使用慢病毒转染体系并用1μg/ml嘌呤霉素进行筛选得到稳定敲低的细胞株。为了检验干扰效率我们提取了细胞的总RNA并使用全式金Easy Script Reverse Transcriptase反转1μg总RNA,同时使用GAPDH m RNA水平进行标准化并将所有基因表达量展现为相对值。细胞增殖,生长和存活分析细胞生长使用MTT法进行分析。细胞使用TKIs处理72 h后进行检测并标准化为空白组的表达。克隆形成实验用来检测细胞生长情况。所有浓度的药物处理经过五次单独的检测并展示为平均值±标准误。数据分析所有的数据都展示为平均值±标准误。使用双尾检测的T检验来检测两组之间的差异,当p0.05是认为存在显著的差异。结果:结果显示EPAS1(NCBI Reference Sequence:NP_001421.2)作为最为同源的基因拥有与HIF-1α48%的相似的氨基酸序列。野生型的EGFR与EPAS1并无结合,然而将790苏氨酸突变为蛋氨酸的质粒Myc-T790M与HA-EPAS1共同转染至NSCLC细胞系HCC827中后,蛋白免疫共沉淀结果显示EPAS1与突变的EGFR具有结合。同样在A549细胞系中也有类似的结果。同样,在A549细胞中EASP1也只与T790M结合而不与野生的EGFR结合,这提示其相互作用不存在细胞特异性。EPAS1与野生型的EGFR确实不存在结合而在添加剂中消除DTT后能够出现T790MEGFR与EPAS1相结合的带,而添加DTT后这种结合消失了,这提示EPAS1与T790M EGFR的结合是直接结合。单独过表达野生型EGFR和T790M EGFR能够显著上调MET的表达量,单独表达EPAS1则对MET的表达量并没有太大影响,并且同时表达EPAS1和野生型EGFR与单独表达野生型EGFR也并未有显著提升,然而同时表达EPAS1和T790M EGFR能够显著上调MET的表达。ΔN-T790M与EPAS1共同转染后能够显著上调MET的表达,这提示EPAS1与T790M EGFR相互作用对MET的激活作用不依赖于配体。共同转染EPAS1与T790M EGFR后HCC827的吉非替尼的EC50提升至10μM以上,埃罗替尼的EC50提升到5μM,而只表达T790M EGFR对照组仅为0.1μM和0.6μM,这提示EPAS1与T790M EGFR的相互作用能够增加NSCLC对TKI抑制剂的耐受性。干扰MET后HCC827的EC50分别下调至0.005μM和0.09μM,这提示EPAS1与T790M EGFR相互作用促进NSCLC对TKI的耐药性是通过MET信号通路来发挥作用的。结论:1在非小细胞肺癌中EPAS1作为HIF-1α同系物可与T790M EGFR相结合2 EPAS1与T790M EGFR相互作用能够不依赖于配体结合而激活MET信号通路3 EPAS1诱导的NSCLC的TKI抵抗是通过T790M EGFR和MET信号通路来发挥作用的第二部分mi R-200a通过靶向EGFR和c-Met抑制NSCLC对吉非替尼的药物抵抗性目的:为了研究mi R-200a在NSCLC中的作用,我们分别用q RT-PCR法检测了NSCLC细胞株(H3255,H1975和HCC827)和正常肺细胞(MRC-5和CCD-19Lu)中mi R-200a的表达量。关于EGFR和c-Met是否为mi R-200a的直接靶点,我们构建了包含mi R-200a匹配EGFR和c-Met 3’UTR的报告基因野生型和突变型质粒。同时我们将EGFR和c-Met报告基因质粒分别与mi R-200a mimics或mi R-NC mimics共同转染至NSCLC细胞中,通过检测荧光表达量检测mi R-200a对EGFR和c-Met的抑制作用。为了验证mi R-200a对NSCLC的作用效果,我们分别在H3255,H1975和HCC827细胞中过表达mi R-200a和mi R-NC,并通过细胞划痕和侵袭实验来检测细胞迁移和侵袭能力。同时使用MTT实验和Brd U实验来检测细胞增殖情况。最后为了检测不同的过表达mi R-200a的NSCLC细胞对吉非替尼的影响,我们使用了细胞增殖和生长实验来检测细胞对不同浓度吉非替尼浓度的影响。方法:细胞培养:人肺正常细胞MRC-5和CCD-19Lu和人肺癌细胞系H3255,H1975以及HCC827购自美国ATCC。H3255具有L858R EGFR等位基因,H1978具有L858R/T790M EGFR等位基因,而HCC827具有EGFR E746-A4750确实。细胞培养严格按照ATCC培养方法进行培养并且在实验全部完成之前不超过6个月。细胞使用含10%胎牛血清以及1%的青链霉素在37℃,5%CO2恒温培养箱中进行培养。将10μM mi RNA寡聚核苷酸以及10μl Lipofectamine 2000分别与500μl Opti-MEM均匀分布后再充分混合并在室温孵育20分钟。将混合液加入到含60%融合度细胞的六孔板中,并在37℃培养两天。Mi RNA转染Hsa-mi R-200a过表达和对照寡聚核苷酸购自ABI公司其序列为5’-UAACACUGUCUGGUAACGAUGU-3。将mi RNA寡聚核苷酸按照说明书进行转染RNA提取和荧光定量PCR反应按说明书使用Trizol对总RNA进行提取。使用Taq Man Pri-mi RNA分析试剂盒对mi R表达量进行分析,使用RNU48作为内参并标准化。为了检测EGFR和c-Met m RNA的表达量使用Easy Script Reverse Transcriptase反转体系对1μg RNA进行反转。从反转好的20μl c DNA中吸取2μl进行实时荧光定量定量PCR反应。荧光素酶报告基因实验将EGFR和c-Metd 3’-UTR区域克隆至p MIR-REPORT报告基因质粒中,其突变质粒使用PCR方法进行构建。将HCC827细胞传到24孔板中每孔80000个细胞。使用Lipofectamine2000法将hsa-mi R-200a或mi R-contro和野生型、突变型报告基因质粒以及p RL-TK分别转染至细胞中。蛋白提取和蛋白免疫共沉淀蛋白使用RIPA裂解液进行提取,配方为50 m M Tris-HCl,p H 7.4,150m M Na Cl,1 m M EDTA,1%Triton X-100,1%脱氧胆酸盐,0.1%SDS使用前添加蛋白抑制剂。将裂解的蛋白12,000 rpm/min 4°C离心10 min。使用SDA-PAGE胶进行蛋白分离并用转膜仪将蛋白转移到PVDF膜上。将转好的膜用PBST(PBS,0.1%Tween-20)溶解的含5%脱脂奶粉的封闭液进行封闭2h,并在4℃孵育EGFR和c-Met一抗过夜。在用PBST清洗后,用含辣根过氧化酶的二抗进行孵育2h后再用PBST清洗后进行爆片。细胞划痕将细胞传至六孔板中,每孔种细胞1×105个病转染mi R-200a或对照核苷酸。使用10μl枪头对细胞进行划痕,去除残余细胞用新鲜的培养基重新培养。在细胞划痕后24h进行拍照。细胞侵袭将1×105转染过mi R-200a和对照的细胞与无血清培养基重悬并传至Matrigel覆盖的小室上方在小室下方放置500μl含10%血清的培养基并在37℃,5%CO2恒温培养箱中进行培养24 h后进行拍照。细胞增殖实验吉非替尼处理和未处理细胞的增殖情况用MTT实验和Brd U实验进行检测。细胞在用吉非替尼处理72后进行检测并换算成对照细胞的相对比例。数据为五次实验的统计并展示为平均值±标准误。数据分析所有的数据都展示为平均值±标准误。使用双尾检测的T检验来检测两组之间的差异,当p0.05是认为存在显著的差异。结果:在正常的肺细胞系MRC-5和CCD-19Lu中mi R-200a的表达量接近,然而与MRC-5细胞相比,H3255细胞中mi R-200a的表达量仅为MRC-5的20%,而H1975和HCC827也只分别为33%和25%。上述结果显示,与正常肺癌细胞相比,mi R-200a的表达量明显下调。结果显示mi R-200a能够显著抑制EGFR和c-Met的野生型荧光素酶报告基因的活性,而突变型对照组则没有显著变化。以上结果显示mi R-200a能够通过靶向EGFR和c-Met的3’UTR区域来抑制其活性。结果显示对照组迁移的平均距离分别为281μm,326μm以及252μm,而转染mi R-200a组迁移的平均距离显著下降到134μm,168μm以及83μm,与对照组相比下调了至少47%。同样与预期一样,转染mi R-200a的NSCLC细胞的迁移能力与对照组相比出现显著下降。此外,MTT法和Brd U法检测细胞活性和细胞增值能力,结果显示,过表达mi R-200a能够显著抑制NSCLC细胞的活性和增殖能力。以上结果显示,mi R-200a能够显著抑制NSCLC细胞的迁移、侵袭和细胞增殖,揭示了mi R-200a对NSCLC细胞功能的抑制作用。各转染对照组的细胞中,含L858R EGFR突变的H3255细胞株对于吉非替尼的抵抗较小其EC50为0.07μM,同时含有L858R和T790M突变的H1975细胞对吉非替尼的耐受最为强烈,其EC50为10μM,而不含二者突变的HCC827细胞作为阴性对照其EC50为10μM。转染mi R-200a后其EC50分别为0.008μM,0.004μM而阴性对照组则没有明显变化。这提示mi R-200a能够提高NSCLC对TKI的药物敏感性。结论:1 mi R-200a在NSCLC细胞中下调2 mi R-200a能够直接靶向抑制EGFR和c-Met的表达3 mi R-200a抑制NSCLC细胞转移和侵袭
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
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本文编号：2191019