无机砷及其活性代谢产物与蛋白相互作用以及抗肿瘤活性研究

发布时间：2018-08-25 08:12

【摘要】：砷属于半金属元素(Semimetal),广泛分布在世界各地,在所有元素中位列第二十。当前,全球砷污染的地下水面积不断扩大,引起了一系列严重公众问题,因而大家对于砷的关注点主要集中在环境方面。根据流行病调查研究发现,砷污染的饮用水可能会导致一系列疾病的发生,例如皮肤角化病,乏力,呕吐,神经病变和癌变等。目前,砷被美国环境保护署(EPA)认定为是致癌物,他们指出长期慢性暴露砷会引起膀胱、肺、肝和皮肤癌。砷除了具有致癌作用,还能导致多种毒性疾病如周围血管疾病,黑脚以及高血压。因此,美国环保署(EPA)和世界卫生组织(WHO)等多个组织规定饮用水中的砷浓度不得超出10pg/L。然而,全球多个国家仍然利用砷生产合金,农药和兽药,环境污染的趋势也在增加。砷在自然界主要以两种形态存在(即有机和无机的形态存在于土壤和水中),而且砷的价态主要有三价和五价之分。研究发现,三价砷的毒性要高于五价砷,其细胞毒性主要取决于细胞摄取砷的含量和积累。研究发现,哺乳类来源的细胞摄取三价砷主要依靠水通道蛋白例如AQP3、7和9通道。而在红细胞和血脑屏障上皮细胞葡萄糖转运体GLUT1参与三价砷的摄取。因此,动物和人摄取三价无机砷的能力要远大于五价无机砷,而产生三价无机砷细胞的毒性强于五价砷。还有,研究发现五价的iAsV主要通过磷酸盐转运体被细胞吸收,尤其在哺乳生物体内,iAsV主要通过Npt2转运体(是一种磷酸盐转运体)进入细胞。但是目前也有研究这对此研究成果持有不同的观点。关于砷的体内代谢机制,研究证实砷在体内与蛋白质(巯基)结合,进而迅速被甲基化。尤其肝脏是砷甲基化的主要器官,iAsⅢ在砷甲基化转移酶(AS3MT)的催化下,产生不同的甲基化代谢产物；这些砷甲基化代谢产物包括单甲基化代谢产物和二甲基化代谢产物。体内已发现三价的甲基化代谢中间产物主要包括MMAIⅢ, DMAⅢ,而五价的甲基化代谢产物主要包括MMAV和DMAV。目前为止,关于无机砷的体内代谢途径仍然不是很明晰。已知的第一种比较经典的代谢途径(1945年,Challenger提出)是无机砷通过氧化还原过程来进行甲基化代谢。在这条途径中,三价的无机砷首先被氧化甲基化形成MMAV,进而MMAV还原成MMAⅢ。之后,MMAⅢ又会被氧化甲基化成DMAV,最终又被还原为DMAⅢ(此学说认为五价的MMAV和DMAV是中间代谢产物)。但是,最近的实验研究发现,当实验动物被五价的无机砷(iAsV)处理后,很少有甲基化的代谢产物(即MMAV和DMAV)生成,这表明在无机砷的生物甲基化过程中,MMAV和DMAV可能是最终产物,而非中间产物。也有研究表明,他们在体内组织中检测不到游离的三价甲基化砷化合物MMAⅢ和DMAⅢ,却发现其以蛋白结合的形态存在。因此,暗示三价的甲基化砷化合物可能是无机砷的中间代谢产物。但是,到目前为止没有体内实验能够证明MMAV和DMAV是无机砷的体内中间代谢产物,而多项结果显示五价的砷化合物是砷的最终代谢产物。2005年,日本的平野科研组提出无机砷的第二种代谢途径。他们认为无机砷发生甲基化反应不通过氧化反应。在第二种新代谢途径中,无机砷主要与谷胱甘肽形成复合体,而此复合体被认为是AS3MT的主要底物。通过与AS3MT相互作用,三价的无机砷谷胱甘肽复合体iAs(GS)3能够被甲基化为M MA(GS)2和DMA(GS)。与第一条代谢途径不同的是,发生甲基化反应时,砷不通过氧化反应进行甲基化反应,甲基化后的三价砷化合物可以氧化为五价的砷化合物。但是,第二条途径没有说明无机砷在甲基化代谢过程是与GSH或AS3MT蛋白相结合。2006年,我们提出了第三种无机砷代谢途径。无机砷是通过与体内富含半胱氨酰残基的蛋白相结合,从而进行一系列甲基化反应,生成一甲基化产物(MMAⅢ)和二甲基化产物(DMAⅢ)。该条涂释表明无机砷在体内是通过三价的形态与蛋白相结合,之后在SAM和GSH的存在下,被AS3MT甲基化为MMAⅢ和DMAⅢ。无机砷在体内的代谢过程被认为是减毒过程,因为在实验动物尿液中发现了五价的甲基化代谢产物。但是,之后在动物和APL病人的尿液中发现了三价的甲基化代谢产物和硫化的砷剂,这引起大家对无机砷的体内代谢转化的更多关注。因此,为了阐明无机砷的体内毒性和临床治疗分子机制,有必要深入研究无机砷在体内的转换、代谢及与蛋白的相互作用。虽然砷具有毒性和致癌性,但它也被认为是一种很好的抗癌药,这体现出这种半金属的矛盾性质,驱使我们去探究不同砷化合物的毒性机制。与此同时,我们也讨论了砷的细胞摄取、蓄积、排泄以及不同形态砷与蛋白质的亲和力,这些都与砷的毒性或治疗效应密切相关。众所周知,砷(三氧化二砷)作为一种有效的抗癌药物,主要用于治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)。目前认为,三氧化二砷能够诱导APL细胞分化为正常细胞,其主要机理是三氧化二砷能够靶向降解APL细胞内的PML-RARα的融合蛋白。最近,三氧化二砷也被用于治疗APL以外的血液学恶性肿瘤,但是确切的抗癌机制还有待阐明。因此,砷的毒性和治疗效果的不同机制还需要更深层次的研究。在本论文中,我们详细讨论了对于砷的致癌性和抗癌功效的机理的见解,进一步解释了砷的代谢途径、代谢产物的多种细胞靶点及其诱导细胞凋亡的分子机制。此外,我们探讨了砷化合物的现在和将来,并深入探讨了砷作为抗癌药物的历程及存在的不足等。在随后的章节中,我们进一步讨论了三氧化二砷作为缓解APL的一线药物的使用情况及对APL缓解和复发治疗的效果。此外,还分析了三氧化二砷及其有机砷化合物对非APL肿瘤的治疗效果,尤其重点探讨了单用砷剂或合用其它抗癌药物治疗不同实体瘤的效果、优点及进一步需要强化的方面。最后,我们详细地总结了砷化合物的抗癌分子机制(例如探讨单用砷剂或与其它化合物合用)。最近的研究发现,细胞对砷的敏感性与转运机制有关,这里我们也强调了砷的摄取和转运途径与其在细胞内的蓄积和与蛋白质的巯基结合有关。早在19世纪,砷曾作为强有力的药物被用于治疗不同的疾病,包括皮肤和乳腺癌、高血压、胃溃疡、风湿、梅毒、牛皮癣、痔疮,甚至是中药牙医中的牙齿填充。然而,1992年至1999年间,三氧化二砷中药制剂(俗称‘"Ailing-1",含有1%的As203)首次被发现具有较好的抗白血病的功效。尤其是,APL病人在三氧化二砷治疗后显示出较好的临床效果,表现出令人难以置信的临床缓解率和较低的毒性。2000年,美国FDA批准三氧化二砷用于APL的治疗。APL的发生机制已被阐明,即15号染色体上的早幼粒细胞白血病(PML)基因和17号染色体上的视黄酸受体α (RARa)基因融合形成嵌合基因,表达PML-RARa融合癌蛋白,此融合蛋白阻碍了早幼粒细胞的成熟,导致APL的发生。关于APL的治疗,目前已证实,高剂量的全反式维甲酸(ATRA)可诱导APL细胞分化。虽然ATRA显示出卓越的诱导细胞分化的能力,但是在病人进行ATRA缓解治疗后超过三到五周,疾病容易复发。因此,ATRA需要和其它化疗药物联合使用。同样,研究发现后天获得ATRA抗性的APL患者不能第二次单用全反式维甲酸来治疗。研究显示,三氧化二砷对使用ATRA治疗复发的APL患者具有很好的疗效。关于砷剂治疗白血病的分子机制研究,报道指出三氧化二砷对PML的半胱氨酸残基有着高亲和力,这可能导致PML-RARa融合蛋白的构象发生变化,最终导致该蛋白的降解。报道认为,三氧化二砷可直接与核质PML及核小体中PML-RARa的PML的锌指区域结合,形成PML-RARa多聚体,或通过使PML-RARa融合蛋白的PML之间形成二硫键进而重组PML-NBS。在此基础上,PML-RARa多聚体通过与泛素结合酶9(UBC9)结合,发生SUMO化,然后经环指蛋白4(RNF4)诱导,进行泛素化,导致其蛋白酶体依赖性降解,最后使得APL细胞分化为正常细胞。此外,三氧化二砷也被用于治疗APL之外的恶性肿瘤或实体瘤。然而,三氧化二砷对实体瘤并没有很好的抗肿瘤效果。但是,三氧化二砷与其他化疗药物的联合治疗策略对除了少数肿瘤之外的其他肿瘤显露出可喜的成果。研究还发现,当AS203注射到APL患者后,体内发生甲基化,生成三价的中间代谢产物,然而,这些甲基化代谢物在治疗白血病过程中究竟起到了什么样的作用,至今没有任何报道和研究。目前大多数研究人员很少注意三价中间代谢物在治疗功效上的贡献。一般来讲,As203注射后会水解成iAsⅢ,然后代谢成甲基化的三价中间代谢产物(如MMAⅢ和DMAⅢ)。与五价的甲基化代谢物相比,三价砷化合物被认为具有较大的毒性。许多研究已经证实,三价甲基化砷被发现可以容易地被吸收并聚集在细胞中,并进一步与各种关键酶或细胞器的半胱氨酸残基相互作用且抑制其活性,最终导致砷毒性。甲基化代谢产物MMAⅢ和DMAⅢ可能影响各种细胞途径,目前已发现其对不同细胞有着不同程度的影响,表明这两种三价甲基化砷代谢产物对细胞有着不同的毒性作用。关于无机砷的细胞毒性,目前有多种解释,其中比较受关注的是无机砷通过与生物大分子相结合来引起细胞毒性,长期可能引起人体细胞发生癌变。无机砷在引起细胞毒性的同时会激活一系列磷酸化依赖的信号途径。在本论文中,我们探讨了砷化合物对蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)的影响研究。众所周知,PTP可以通过调节酪氨酸受体水平来调节磷酸化依赖的信号通路。所以,我们希望能够发现iAsⅢ及其中间代谢产物与PTP之间的关系。我们的实验结果表明,三价砷的中间代谢产物能够强烈抑制PTP1B和CD45的活性,但是无机砷却不能。我们的研究结果显示,甲基化砷可能通过PTP失活来干扰正常的细胞信号通路(详细内容参照正文)。另外,我们比较了三价砷(包括iAsⅢ、MMAⅢ、DMAⅢ)抗白血病的活性及其作用机制。此课题以人粒细胞白血病HL-60细胞系为主要研究对象。为了研究可能参与诱导HL-60细胞毒性的砷化物的靶点,我们用相同浓度的三种砷化合物分别处理细胞,检测了活性氧的生成情况和DNA的损伤程度等诱导细胞凋亡的分子机制。本实验中,三价的砷代谢产物MMAⅢ和DMAⅢ分别通过用L-半胱氨酸在90摄氏度还原五价的MMAV和DMAV制备。细胞存活率用MTT法测定。细胞摄取砷含量通过ICP质谱进行测定。Western blot法用来检测HL-60细胞中Caspase-9,Caspase-3和PARP等蛋白的表达。Caspase-3的特异性底物(AC-DEVD-pNA)用来测量细胞内Caspase-3的活性。细胞凋亡率通过流式细胞仪结合Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色来检测。结果显示,三价的甲基化代谢产物(即MMAⅢ和DMAⅢ)具有较强的细胞毒性,其毒性强于无机砷(iAsⅢ)。MTT结果表明,iAsⅢ的IC50值大约为10μM,然而,MMAⅢ和DMAⅢ在较低浓度(分别为3和2μM)显著抑制了细胞增殖。较低剂量的MMAⅢ和DMAⅢ也能显著诱导细胞凋亡。为了观察MMAⅢ和DMAⅢ是否能通过诱导凋亡从而诱导细胞死亡,我们使用Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色检测HL-60细胞的凋亡率。结果显示,MMAⅢ和DMAⅢ显著诱导HL-60细胞凋亡。此外,NAC预处理HL-60细胞后,MMAⅢ和DMAⅢ诱导的凋亡被有效抑制,这表明ROS产生可能是MMAⅢ和DMAⅢ诱导HL-60细胞凋亡的主要原因。此外,western blot结果显示,HL-60细胞在MMAⅢ和DMAⅢ处理后,caspase-3和caspase-9有明显的上调,并且,PARP也有明显的裂解片段生成。而在NAC预处理的HL-60细胞中,caspase-3、caspase9和PARP三种蛋白均有明显的变化。但是,iAsⅢ并没有类似的作用效果。为了更加了解iAsⅢ对HL-60细胞的作用,我们进行了深入的实验研究。首先,我们利用氧化荧光敏感探针(DCFH-DA)测定细胞体内的活性氧(ROS)变化,并用流式细胞术检测ROS的含量。γ-H2AX是一种DNA受损的标志物,我们使用免疫荧光法来检测它的诱导情况。研究结果显示,氧化应激在iAsⅢ的中间代谢产物(MMAⅢ和DMAⅢ)引起细胞凋亡过程中起着至关重要的作用,它不仅能够引起线粒体膜电位的改变、DNA的损伤,同时它也能够引起caspase家族的一系列级联反应。我们的实验结果表明,三价无机砷的中间代谢产物比于iAsⅢ有更好的治疗效果。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-36

【相似文献】