Wnt通路抑制基因表观遗传学变化与急性白血病的关系及Genistein对Wnt通路抑制基因组蛋白修饰的影响

发布时间：2018-08-30 08:43

【摘要】：目的:本研究探讨Wnt通路抑制基因表观遗传学变化,组蛋白修饰与急性白血病相关基因表达的关系,Genistein对Wnt通路抑制基因转录调节的影响、组蛋白修饰的影响和可能的机制;为白血病的表观治疗提供新的思路。方法:1.以qRT PCR法检测急性白血病患者和正常人Wnt通路拮抗基因(Wnt5a,HDPR1,DKK1,DKK3)mRNA表达水平,焦磷酸盐测序(Pyrophosphate sequencing)、甲基化特异性PCR(MSP)检测Wnt5a基因启动子区甲基化状态,以Western Blot方法检测急性髓细胞白血病、正常人Wnt5a蛋白和组蛋白H4K20me1总表达水平,分析Wnt5a蛋白表达与组蛋白H4K20me1之间的相关性;2.以Genistein作用于Wnt通路拮抗基因(Wnt5a、HDPR1、DKK1、DKK3)高甲基化失活的Jurkat、U937细胞,观察细胞增殖、凋亡和细胞周期变化,检测Wnt通路拮抗基因、H4K20me1甲基转移酶(set8)及Wnt通路下游靶基因AXIN2、c-myc等基因表达变化,通过BSP技术、焦磷酸盐测序检测对照组和加药组之间Wnt5a启动子区甲基化变化,以染色质免疫共沉淀(CHIP-qPCR)技术,检测对照组和加药组Wnt5a基因启动子区和编码区H4K20me、H3K9ac富集程度变化,分析Genistein如何通过组蛋白修饰对Wnt信号传导通路下游靶基因表达进行调控,探索Wnt5a恢复表达与组蛋白H4K20me1的关系,及Genistein引起凋亡、细胞周期变化的可能机制。3.设计合成携带过表达Wnt5a基因载体的慢病毒,对低表达Wnt5a的Jurkat细胞和Kasumi细胞进行感染,检测过表达Wnt5a对增殖、细胞周期以及凋亡水平等细胞生物学活性的影响,并以Western Blot法检测Wnt通路关键效应蛋白β-catenin、下游靶基因c-myc、组蛋白H4K20me1、细胞周期(G2/M期)相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达改变,探讨Wnt5a基因在白血病细胞中的对抗增殖、诱导凋亡、阻滞细胞周期的机制。结果:1.Wnt通路拮抗基因(Wnt5a,HDPR1,DKK1,DKK3)在急性髓系白血病中呈广泛低表达,但在淋巴细胞白血病中表达呈现差异,其中Wnt5a在急性T淋巴细胞白血病中亦低表达,DKK3在髓系、淋系急性白血病中普遍降低,而HDPR1在急淋患者中表达与正常人无显著性差异,DKK1在急淋患者中表达显著高于正常人。2.急性髓系白血病患者中普遍存在Wnt5a基因甲基化,导致其表达量下降。3.急性髓系白血病患者中H4K20me1总蛋白量较正常人升高,且Wnt5a表达量与H4K20me1表达量呈正相关,与H4K20me1富集于Wnt5a启动子区、编码区有关。而在正常人中,Wnt5a表达量与H4K20me1表达量无相关性。4.以Genistein干预Wnt拮抗基因甲基化失活的Jurkat、U937细胞系,在体外能够抑制Jurkat、U937细胞增殖,阻滞细胞周期进程,并诱导凋亡,其作用机制与激活H4K20me1甲基转移酶(set8),提高H4K20me1在Wnt5a等启动子区富集,从而激活Wnt通路抑制基因,抑制Wnt/β-catenin信号途径有关;与Wnt5a启动子甲基化状态无关。考虑组蛋白修饰状态改变对Wnt通路抑制基因的激活起关键作用。改变组蛋白的修饰状态,可以不通过逆转甲基化状态达到调控基因表达的目的。5.在低表达Wnt5a的细胞系Jurkat、Kasumi中,过表达Wnt5a基因,可以抑制细胞增殖、促进凋亡、阻滞细胞周期于G2/M期,与Genistein诱导细胞出现凋亡和周期阻滞的改变相似,考虑Genistein抗肿瘤作用主要通过提高Wnt5a表达实现;Wnt5a过表达对组蛋白H4K20me1表达无影响;因Wnt5a在白血病细胞中可以发挥明显的抗肿瘤作用,可能成为基因治疗的重要靶点。结论:急性白血病患者中普遍存在Wnt通路拮抗基因的甲基化,其中在AML患者中尤为显著,ALL则因不同患者和类型有一定差异;患者Wnt5a基因表达与基因启动子区、编码区H4K20me1富集倍数呈正相关,H4K20me1通过促进转录起始和转录延伸提高Wnt5a的表达水平;Genistein干预白血病细胞促进抑癌基因Wnt5a表达的重要机制是在Wnt5a启动子区、编码区富集H4K20me1,与启动子区甲基化状态无关;Wnt5a基因在细胞周期阻滞、诱导凋亡、抗增殖的作用方面具有与Genistein相似的作用机制,均可以阻止CDK1激酶活性和诱导P21上调,激活非经典Wnt通路,导致β-catenin下调,Wnt经典通路下游基因转录受抑。
[Abstract]:Objective: To explore the epigenetic changes of Wnt pathway inhibitor gene, the relationship between histone modification and the expression of genes related to acute leukemia, the effect of Genistein on the transcriptional regulation of Wnt pathway inhibitor gene, the effect of histone modification and its possible mechanism, and to provide a new idea for the epigenetic treatment of leukemia. Methods: 1. Quantitative RT PCR was used to detect the expression of genes related to Wnt pathway inhibitor. Expression of Wnt pathway antagonist gene (Wnt5a, HDPR1, DKK1, DKK3) mRNA in patients with acute leukemia and normal controls, Pyrophosphate sequencing, methylation-specific PCR (MSP) were used to detect methylation status of Wnt5a promoter region, and Western Blot was used to detect acute myeloid leukemia, Wnt5a protein and histone H4K20 in normal controls. To analyze the correlation between the expression of Wnt5a protein and histone H4K20me1; 2. Genistein was used to treat hypermethylation-inactivated Jurkat and U937 cells with Wnt pathway antagonist genes (Wnt5a, HDPR1, DKKK1, DKK3), to observe cell proliferation, apoptosis and cell cycle changes, to detect Wnt pathway antagonist gene, H4K20me1 methyltransferase (set8) and Wnt pathway antagonist gene. The methylation of Wnt5a promoter region was detected by BSP and pyrophosphate sequencing. The enrichment of H4K20me and H3K9ac in the promoter region and coding region of Wnt5a gene in the control group and the drug group was detected by chromatin immunoprecipitation (CHIP-qPCR). To analyze how Genistein regulates the expression of target genes downstream of Wnt signal transduction pathway by histone modification, to explore the relationship between the recovery of Wnt5a expression and histone H4K20me1, and the possible mechanism of Genistein-induced apoptosis and cell cycle changes. Cells and Kasumi cells were infected to detect the effects of Wnt5a overexpression on cell proliferation, cell cycle and apoptosis. The expression of key effector protein beta-catenin, downstream target gene c-myc, histone H4K20me1, cell cycle (G2/M phase) related protein and apoptosis related protein were detected by Western Blot assay. To investigate the mechanism of Wnt5a gene in leukemia cells by antagonizing proliferation, inducing apoptosis and blocking cell cycle. Results: 1. Wnt5a (Wnt5a, HDPR1, DKK1, DKKK3) was widely low expressed in acute myeloid leukemia, but the expression of Wnt5a was different in lymphocytic leukemia, especially in acute T lymphocytic leukemia. The expression of DKK1 in AML patients was significantly higher than that in normal controls. 2. The methylation of Wnt5a gene was common in AML patients, resulting in a decrease in the expression of H4K20me1. The expression of Wnt5a was positively correlated with the expression of H4K20me1, and was related to the coding region of H4K20me1, which was enriched in the promoter region of Wnt5a. However, there was no correlation between the expression of Wnt5a and the expression of H4K20me1 in normal people. Kat, U937 cells proliferate, block cell cycle progression, and induce apoptosis. Its mechanism is related to activating H4K20me1 methyltransferase (set8), increasing H4K20me1 enrichment in promoter regions such as Wnt5a, thus activating Wnt pathway inhibitor genes, inhibiting Wnt / beta-catenin signaling pathway, and not related to Wnt5a promoter methylation status. Changes in histone modification can regulate gene expression without reversing methylation. 5. Overexpression of Wnt5a gene in Jurkat, Kasumi cells with low expression of Wnt5a can inhibit cell proliferation, promote apoptosis and block cell cycle at G2/M phase, and Geni phase. Stein induced apoptosis and cell cycle arrest similar changes, considering the anti-tumor effect of Genistein is mainly achieved by increasing the expression of Wnt5a; Wnt5a overexpression has no effect on histone H4K20me1 expression; because Wnt5a can play an obvious anti-tumor role in leukemia cells, may become an important target of gene therapy. Wnt pathway antagonist gene methylation is common in patients with hematological diseases, especially in AML patients, and ALL has certain differences due to different patients and types; Wnt 5A gene expression is positively correlated with gene promoter region, coding region H4K20me1 enrichment multiple, H4K20me1 promotes Wnt 5A expression by promoting transcriptional initiation and transcriptional extension Genistein interferes with the expression of tumor suppressor gene Wnt5a in leukemia cells by enriching H4K20me1 in the promoter region of Wnt5a, which is not related to the methylation status of promoter region; Wnt5a gene has a similar mechanism with Genistein in cell cycle arrest, apoptosis induction and anti-proliferation, and can prevent CDK1 kinase. P21 activity and induction up-regulate, activate non-classical Wnt pathway, lead to down-regulation of beta-catenin, Wnt classical pathway downstream gene transcription is inhibited.
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.71

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本文编号：2212567