miR-145-3p靶向HDAC4调控多发性骨髓瘤细胞凋亡与自噬的作用及机制研究

发布时间：2018-09-01 16:40

【摘要】：多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)是一种恶性血液疾病,其特征是骨髓(bone marrow,BM)中浆细胞异常克隆增殖,分泌大量的单克隆免疫球蛋白或其片段,导致肾脏、骨骼等组织或器官的损伤。MM发病率约占所有恶性血液病的10%,好发于老年人,随着我国人口老龄化的进展,MM发病人数有增加的趋势。常见临床表现为骨痛、贫血、肾功能不全或免疫力低下等。目前治疗MM的主要手段有激素、免疫调节剂、烷基类药物、蛋白酶抑制剂等,主要是在造血干细胞、抑制蛋白酶体的功能、诱导细胞凋亡、调节骨髓微环境及细胞因子的功能等方面进行调控和干预。多发性骨髓瘤发病机理复杂,遗传学上的基因突变并不能完全解释和阐明多发性骨髓瘤发生发展过程的复杂性。越来越多的研究表明,表观遗传学调控方式,包括非编码RNA尤其是微小RNA(micro RNA,mi RNA)、DNA甲基化、组蛋白修饰等调控,在多发性骨髓瘤的发生发展过程中起着重要的作用。mi RNA是一系列长度约为21-23个核苷酸的非编码RNA分子,其与下游调控的靶基因m RNA的3’端非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)存在特异性的结合位点,导致m RNA的降解或蛋白质翻译的抑制,从而平衡靶分子的表达及其相应的生物学功能,mi RNA通过该转录后途径几乎参与了所有生命活动过程的调节。最近的研究提供证据表明mi RNA在MM的生物学中发挥关键作用,可能成为临床治疗的靶点。mi R-145是近年来发现一种新的mi RNA分子,可以参与调控细胞侵袭、转移、增殖、分化及凋亡等过程。已有研究表明,mi R-145-5p可以调控多发性骨髓瘤细胞的凋亡发挥治疗作用,提示mi R-145可以作为潜在的治疗靶点来干预疾病进展,但是mi R-145-3p在MM中的表达水平,其能否作为疾病的诊断及预后等分子标志物还未明确,在调控细胞生物学效应的作用及具体机制也有待阐明。此外,在临床药物治疗中,诱导细胞凋亡是重要的作用方向之一,在线粒体介导的细胞凋亡中,细胞色素c和线粒体蛋白Smac释放出来,还可与调亡蛋白酶活化因子(apoptotic protease activating facter-1,Apaf 1)结合形成多聚复合物,并与Caspase9结合形成凋亡小体,激活Caspase3等级联反应,引起细胞凋亡。除了线粒体介导的凋亡外,还有内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介导的凋亡,内质网应激活化未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)来调控细胞凋亡,Chop、凋亡信号激酶ASK1/JNK、Bcl 2家族和caspase 12等分子参与其中,内质网应激诱导的凋亡与线粒体诱导的凋亡的作用相互交叉,Chop和活化的JNK可以激活Bax等促凋亡蛋白,使线粒体凋亡途径激活,导致细胞凋亡。在多发性骨髓瘤患者的临床药物治疗中,部分病人会出现Bcl 2家族蛋白调控失控导致凋亡途径异常,出现对治疗药物如地塞米松(dexamethasone,DEX)的耐受。因此如果能恢复上述正常的凋亡机制,将能够有效提高临床药物的治疗效果,在此过程中,我们希望探讨mi R 145 3p可能发挥的调控细胞凋亡作用。除调控细胞凋亡外,在多发性骨髓瘤临床治疗中,调控细胞自噬(autophagy)也是其治疗方向之一。在多发性骨髓瘤中,浆细胞恶性增殖产生大量的免疫球蛋白,引起内质网应激,错误折叠蛋白增多,细胞需要自噬来清除这些蛋白质以维持生存,此外骨髓瘤细胞的快速增殖以及免疫球蛋白大量合成,机体能量需求增多,也使得自噬增加,这时自噬可起到保护细胞的作用,但是当外界刺激作用过强时,过度自噬可能会导致细胞凋亡,当错误折叠蛋白超过蛋白酶体和自噬的处理能力时,则造成错误折叠蛋白堆积,出现过度自噬,使得自噬由抑制凋亡向诱导死亡转换。因此,促进过度自噬可以导致细胞死亡增多,增强临床治疗效果,这提示我们调控自噬及其所诱导的细胞死亡也是MM临床治疗的方向之一。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)通过去除组蛋白上的乙酰基调节肿瘤发生进展过程,它们的功能紊乱是肿瘤发生发展的重要分子机制之一,HDAC已经成为包括多发性骨髓瘤在内的多种临床疾病治疗的重要靶点之一。调控细胞的凋亡是组蛋白去乙酰化修饰调控及功能的研究热点,HDAC抑制剂可诱导细胞发生线粒体途径的凋亡,HDAC抑制剂活化caspase 9导致细胞凋亡,还可以上调Bcl 2家族中促凋亡蛋白Bim等,下调抑凋亡蛋白Bcl 2等。此外,在乳腺癌细胞中,当敲除HDAC时,可以导致自噬标志蛋白LC3 Ⅱ表达增加。HDAC4是重要的组蛋白去乙酰化酶之一,在MM中,HDAC4表达水平是否存在异常,调控的下游分子以及HDAC4在细胞自噬及所导致的凋亡中的作用还不是特别清楚。在此基础上,我们希望探讨mi RNA 145 3p在上述凋亡与自噬中的作用,重点探讨以下问题:循环mi RNA是否在多发性骨髓瘤患者外周血中异常表达,该异常表达在疾病的诊断及预后中的作用;mi RNA是否参与调控多发性骨髓瘤细胞的凋亡与自噬等生物学效应;mi RNA是否参与调控HDAC以及下游信号分子等具体靶点及作用机制,本文利用定量PCR技术、生物信息学工具、经典分子生物学技术、蛋白印迹等,在临床样本、分子水平、细胞水平研究了循环中非编码RNA参与的表观遗传调控对多发性骨髓瘤生物学行为的影响,获得了如下结果:第一部分循环mi R 145 3p在MM中的表达与临床应用价值近年来发现肿瘤患者外周血中可检测出某些特定mi RNA分子,称为循环mi RNA,具有多次取材、检测方便、稳定不易降解等优点。在多发性骨髓瘤中,研究发现mi R 21在患者血浆中表达水平升高,与部分临床指标呈现一定的关联性,还发现血浆中循环mi R 148a、mi R 99b、mi R 221等表达水平升高,与t(4∶14)、13q缺失等基因改变存在一定的关联性,这些结果暗示了循环mi RNA作为临床诊断及预后等标志物的可能性。本部分实验主要目的是研究多发性骨髓瘤患者血浆中mi RNA表达情况以及筛选出mi RNA分子在临床诊断及预后中的潜在应用价值。本实验室首先采用Taq Man micro RNA表达谱芯片筛选MM患者(为ISS12期和3期患者)及正常对照人群各3例血浆中表达异常的mi RNA分子,分析发现在两组间共存在25个异常表达的mi RNA分子(flod change2,p0.05),其中23个mi RNA表达升高,2个表达水平降低,证实mi R-145-3p在MM患者血浆中显著低表达。然后进一步采用荧光定量PCR技术在多发性骨髓瘤患者外周血浆中(为ISS分期2期13例,3期患者17例,共30例病人)证实了芯片的筛选结果。同时我们利用定量PCR技术对多种MM细胞株LP-1、U266、PRMI-8226、H929、KM3等进行检测,选取正常人骨髓中CD138+浆细胞作为正常对照,结果发现在多种骨髓瘤细胞株LP-1、U266、PRMI-8226、H929中,mi R-145-3p表达水平较低(KM3细胞株除外),与MM患者血浆中表达水平相一致。我们进一步探讨该mi RNA分子与临床指标的关联性,包括各种临床指标:血清白蛋白、β2-微球蛋白(β2-microbulin,β2-MG)、血清肌酐、血清Ca2+、免疫球蛋白、患者预后指标无进展生存期(Progression Free Survival,PFS)等临床参数。结果发现mi R-145-3p与β2-MG呈显著负相关(r=-0.429,p=0.02),与血清白蛋白呈正相关(r=0.419,p=0.021),与血清肌酐呈负相关(r=-0.370,p=0.044),与血清Ca2+呈显著负相关(r=-0.644,p0.01),与其它指标如Ig A、Ig G、Ig M等无相关性,在临床预后中,mi R-145-3p表达较高的MM患者的无进展生存期较长,这些结果提示mi R-145-3p除了具有一定的诊断和预后价值外,还可能参与了多发性骨髓瘤细胞的生物学进程。第二部分mi R 145 3p调控多发性骨髓瘤细胞凋亡与自噬的生物学效应研究表明mi RNA可以参与MM的发生发展,mi R 21通过SPRY2调控MAPK/ERK信号,介导骨髓瘤细胞的生长及耐药,mi R 148a通过靶向CDKN1B和PTEN调控细胞增殖和凋亡。在前期研究中我们发现mi R 145 3p在患者血浆中降低,并且该分子的低水平与患者较差的预后相关,但该分子参与MM发病的机理不明。因此本部分通过构建mi R 145 3p mimic来过表达mi R 145 3p,RNAimax试剂转染多发性骨髓瘤细胞LP 1,通过流式细胞术、CCK 8试剂盒、定量PCR、蛋白印迹电泳等技术,探讨mi R 145 3p对多发性骨髓瘤细胞的生物学效应,结果发现:mi R 145 3p mimic可以显著抑制细胞增殖,并且该抑制作用呈现时间依赖性;此外,过表达mi R 145 3p还可以诱导多发性骨髓瘤细胞发生凋亡,Annexin V阳性细胞增多,在m RNA和蛋白水平显示,凋亡相关分子Caspase 3、Apaf 1表达水平显著上调,Bcl 2表达水平显著下调。值得一提的是,流式细胞结果显示,当与MM临床药物地塞米松联合使用时,mi R-145-3p可以增强地塞米松诱导细胞凋亡的作用。蛋白印迹电泳结果显示,mi R 145 3p过表达还可以诱导细胞发生自噬,自噬关键标志物LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ转换增多,Beclin 1显著上调,P62显著下调。我们进一步采用自噬抑制剂羟氯喹(hydroxychloroquine,HCQ)抑制自噬后,流式结果显示细胞凋亡减少。上述结果提示,mi R 145 3p过表达可以抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡和自噬,并且可能是通过诱导细胞自噬来诱导细胞凋亡的。与MM临床药物地塞米松联合使用时,mi R 145 3p可以增强其诱导细胞凋亡的作用。第三部分mi R 145 3p调控多发性骨髓瘤细胞凋亡与自噬的作用靶点及具体机制前期实验我们已经筛选并确定mi R 145 3p在多发性骨髓瘤中表达水平较低,其低表达与患者预后差正相关,并且mi R 145 3p过表达可以抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡和自噬,并且可能是通过诱导细胞自噬来诱导细胞凋亡的,但是mi R 145 3p调控多发性骨髓瘤细胞凋亡与自噬的具体作用靶点及机制还不清楚。在本部分,我们进一步探讨mi R 145 3p发挥调控效应的具体机制,利用Targetscan、mi Rwalk等生物信息学软件和工具预测mi R 145 3p的作用靶点,采用荧光定量PCR检测预测靶分子在多发性骨髓瘤患者血浆中表达水平,采用荧光定量PCR和蛋白印迹电泳观察mi R 145 3p过表达后靶分子的表达水平,进一步采用荧光素酶报告系统检测mi R 145 3p与靶分子的3’UTR是否存在直接的结合位点;通过靶分子的si RNA观察细胞凋亡与自噬的变化情况;采用蛋白印迹电泳观察过表达mi R 145 3p后下游活化转录因子(activating transcription factor 4,ATF4)的表达情况,凋亡中关键信号通路分子p53 p21的表达情况,自噬通路中关键分子ULK1、PI3KC3及LAMP2的表达情况,以探讨mi R 145 3p发挥调控作用的具体机制。结果发现,生物学信息学结果提示HDAC4是mi R 145 3p的作用靶点之一,定量PCR结果显示在多发性骨髓瘤患者骨髓中HDAC4表达水平升高,并且与mi R 145 3p表达水平呈负相关,细胞转染实验表明过表达mi R 145 3p可以下调HDAC4的m RNA水平和蛋白水平,荧光素酶报告系统证实mi R 145 3p与HDAC4的3’UTR存在直接的结合位点。在明确HDAC4是mi R-145-3p的靶分子后,进一步采用si RNA干扰实验,结果发现干扰HDAC4与过表达mi R 145 3p同样可以诱导细胞凋亡与自噬,无显著性差异(p0.05)。通过分析下游分子,我们发现mi R 145 3p靶向HDAC4可以导致转录因子ATF4的表达水平升高,这提示mi R 145 3p可能是通过靶向HDAC4发挥调控细胞凋亡与自噬,并且上调ATF4的表达,进而影响到凋亡和自噬相关基因的表达。针对凋亡与自噬通路中的关键蛋白的检测结果显示,mi R 145 3p过表达可以上调凋亡通路中P21的表达,下调P53的表达,上调自噬过程中关键分子的ULK1(Ser638)以及LAMP2的表达水平,而对PI3KC3的表达水平无显著影响。这些结果提示mi R 145 3p可能靶向HDAC4上调ATF4的表达,进而影响到凋亡和自噬相关基因的表达来调控细胞凋亡与自噬,在凋亡和自噬通路中,可能分别是通过非p53依赖的P21上调、ULK1及LAMP2的上调来介导发挥调控作用。综上所述,本研究通过芯片筛选、定量PCR技术证实mi R 145 3p在多发性骨髓瘤患者中低表达,并且与血清白蛋白、β2-MG等临床指标存在一定的相关性。Mi R 145 3p通过靶向HDAC4上调ATF4的表达,从而诱导MM细胞发生凋亡与自噬等生物学现象,并且mi R 145 3p可能是通过诱导细胞自噬来诱导细胞凋亡,当与地塞米松联合使用时,能够增强其诱导细胞凋亡作用。对关键信号通路的研究表明,P21和ULK1及LAMP2信号通路参与了mi R 145 3p对MM细胞凋亡和自噬的过程,该结果可能为多发性骨髓瘤发生、发展提供新的理论依据,为mi R 145 3p-HDAC4作为治疗靶点奠定了一定的实验基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.3

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