【摘要】：第一部分负载AIE分子的双信号核磁造影剂对肿瘤靶向成像的应用及毒性研究 目的：依赖EPR效应,研究负载AIE分子的双信号核磁造影剂四苯基乙烯-2钆(TPE-2Gd)在肿瘤靶向成像中的效果,评价TPE-2Gd在细胞、动物水平的毒性作用 方法：①建立小鼠皮下肿瘤模型,尾静脉分别注射TPE-2Gd和商业造影剂马根维显,采用核磁共振仪对小鼠肿瘤部位行核磁扫描检查,比较TPE-2Gd与马根维显在皮下肿瘤成像中的效果。②在细胞水平,HE染色观察TPE-2Gd处理后,细胞形态改变；采用CCK8观察TPE-2Gd对细胞生长增殖的影响。采用活性氧荧光探针DCFH-DA,流式细胞仪及荧光显微镜两种方法检测TPE-2Gd对细胞内活性氧生成的影响。采用PI/Annexin V染色观察TPE-2Gd对细胞凋亡和坏死的影响。③在动物水平,采取SD大鼠动脉血行溶血试验,观察TPE-2Gd对血细胞的毒性作用。以SD大鼠为模型,静脉注射TPE-2Gd或生理盐水,观察两组在不同时点大鼠的行为、体重改变。抽血检测两组动物血细胞、血红蛋白量、炎性细胞等血象指标,检查肝内酶学、血肌酐尿素氮等指标判断大鼠肝肾功能改变。在不同时点,颈椎脱臼法处死大鼠后,取重要内脏器官行HE染色观察有无炎性改变。 结果：①予小鼠皮下注射同种属来源的H22肝癌细胞,成功构建了皮下肿瘤模型。核磁共振仪扫描结果显示TPE-2Gd组和马根维显组药物注射后较平扫期肿瘤部位信号均增强。而TPE-2Gd组较马根维显组磁共振信号增强效果更明显,且TPE-2Gd组在肿瘤部位衰减更慢,滞留时间更长。②细胞水平,细胞HE染色提示TPE-2Gd对HeLa细胞及3T3细胞的形态改变均无影响。CCK8实验结果表明TPE-2Gd对细胞生长增殖毒性小,生物相溶性好。细胞内活性氧检测表明TPE-2Gd对细胞内活性氧的产生和增加无影响。细胞凋亡和坏死的研究表明TPE-2Gd未诱导细胞凋亡的发生及细胞坏死的增加。③动物水平,溶血试验表明TPE-2Gd未诱发红细胞破裂,溶血发生。予尾静脉注射TPE-2Gd组和生理盐水组在SD大鼠生长过程中的精神状态,体重增长速度等方面无统计学差异,各血象指标亦无统计学差异,注射TPE-2Gd组肝肾功能较生理盐水组无差别。两组在不同时点采集的各组织器官HE染色未见炎性改变。结论：本研究成功建立小鼠皮下肿瘤模型,并通过核磁仪检测TPE-2Gd作为新型双信号核磁造影剂对皮下肿瘤的靶向成像效果。带有2个Gd原子的TPE-2Gd较只有1个Gd原子的马根维显对皮下肿瘤有更好的信号增强效果,以纳米形式存在的TPE-2Gd依赖EPR效应更易滞留于肿瘤组织中,增加了肿瘤成像的靶向性。作为活体应用的生物材料,材料的生物相容性、细胞毒性和材料对机体生长繁殖的影响是重要的检测项目。本实验从细胞水平证明了TPE-2Gd对细胞的形态、生长增殖和活性氧的产生均无影响,对诱导溶血的发生及细胞凋亡亦无作用。动物实验表明TPE-2Gd对SD大鼠的精神状态、生长发育及肝肾功能等均无影响,亦无诱导体内炎症的发生。综上所述负载有AIE荧光分子的新型双信号核磁造影剂毒性小,生物相溶性好,且可增强造影信号强度,延长成像时间,有望成为新一代优良的肿瘤靶向成像材料。 第二部分基于AIE发光机理的线粒体荧光探针的合成、表征及在细胞自噬研究中的应用 目的：制备具有聚集诱导发光(AIE)特性的线粒体荧光探针(TPE-Py-NCS),评价荧光探针的理化特性、AIE特性和光稳定性以及生物亲和性,并探讨其在观察线粒体自噬中的应用价值。 方法：将TPE-Py-N3经化学修饰得到TPE-Py-NCS分子。通过核磁(NMR)、高分辨质谱(HRMS)分析检测产物TPE-Py-NCS化学结构。采用动态光散射(DLS)测定纳米颗粒的水合粒径、分散性,紫外/可见光谱仪、荧光分光光度计表征TPE-Py-NCS的光物理性能。以不同比例的二甲基亚砜(DMSO)和水的混合溶液观察TPE-Py-NCS的AIE特性。MTT法评价TPE-Py-NCS的细胞毒性。以相似相容原理,采用丙酮冲洗染色后的细胞,判断荧光探针与线粒体的结合方式。若该荧光探针与线粒体只是电荷吸引结合,则该探针容易被有机溶剂如丙酮溶解,并冲洗掉。若该荧光探针与线粒体通过化学反应结合,则该探针不能被有机溶剂溶解、冲洗。以CCCP处理细胞致线粒体膜电位降低,观察荧光探针TPE-Py-NCS在线粒体电位降低后的荧光染色表现。采用激光共聚焦扫描显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM)连续激发染色细胞以评价荧光探针的光稳定性。以雷帕霉素诱导HeLa细胞自噬发生,CLSM采集自噬发生后不同时间点图像,观察自噬过程中线粒体与溶酶体的融合过程。同时CLSM连续激发染色细胞比较新型AIE探针(TPE-Py-NCS)与传统商用MitoTracker(?) Red CMXRos探针在自噬中的光稳定性表现。 结果：合成得到TPE-Py-NCS分子,核磁(NMR)和高分辨质谱(HRMS)验证无误。DLS检测显示TPE-Py-NCS在含0.1%的DMSO的水溶液中,粒径为纳米级,分散性好。紫外/可见光谱仪、荧光分光光度计显示TPE-Py-NCS在DMSO溶液中的最大吸收波长为397nm,最大发射峰在638nm。不同比例的DMSO/H_2O的混合溶液证明了TPE-Py-NCS的AIE特性,即TPE-Py-NCS在良溶剂中处于溶解状态,发微弱荧光,在不良溶剂中聚集,荧光增强。MTT结果显示TPE-Py-NCS对细胞生长繁殖毒性小,生物相溶性好,可用于细胞染色。细胞内实验结果表明TPE-Py-NCS可特异性靶向线粒体染色,选择性和特异性好,与商业化的线粒体荧光探针共染的重叠率达97%。该荧光探针既可染活细胞也可对固定后的细胞染色。TPE-Py-NCS与线粒体结合力实验显示,TPE-Py-NCS对CCCP处理后的膜电位降低的线粒体仍可染色。细胞染色后用丙酮冲洗细胞仍清晰可见标有黄色荧光的线粒体,提示TPE-Py-NCS与线粒体以化学键结合。CLSM连续激发染色细胞证实该荧光探针的光稳定性良好,可持续激发扫描10分钟以上。以TPE-Py-NCS为黄色线粒体荧光探针,LysoTracker Red为溶酶体红色荧光探针,雷帕霉素诱导后72分钟见细胞内有自噬溶酶体出现,持续约8分钟后消失。CLSM连续激发染色细胞可见TPE-Py-NCS比MitoTracker Red光稳定性更好,可用于持续观察细胞的自噬过程。 结论：通过TPE-Py-N3与CS2的反应,得到了TPE-Py-NCS荧光探针,该荧光探针带正电荷,可特异性结合膜电位为负值的细胞器--线粒体。以静电吸引与线粒体结合后,该探针的NCS官能团可与线粒体蛋白的NH2反应,以化学键紧密结合在线粒体上,可抵御线粒体周围的各种微环境变化,如在自噬过程中会出现的去极化及区域性酸化等。TPE-Py-NCS具有AIE特性,即在良溶剂中荧光较弱,在不良溶剂如PBS、细胞培养基中荧光增强。该荧光探针以良好的生物相容性用于细胞染色,并表现出良好的光稳定性。在观察白噬这样一个持续动态的过程中,良好的抗光漂白作用是荧光探针必须具备的关键特征。TPE-Py-NCS在观察自噬过程中表现出了良好的抗光漂白效果,为自噬过程的研究提供了帮助。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-3
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本文编号：
2239658
