褐藻多糖对M2型巨噬细胞CCL22表达的影响与机制研究及外周血粒淋比作为肿瘤预后评价指标的影响因素分析

发布时间：2018-09-18 10:19

【摘要】：第一部分褐藻多糖对M2型巨噬细胞CCL22表达的影响与机制研究研究背景免疫系统是机体重要的系统之一,通过特异的识别“自我与非己”成分,行使免疫防御(抵御外来病原微生物感染)、免疫监视(监视并清除恶性肿瘤细胞等)以及免疫自稳(维持内环境平衡)三大功能。大量研究证实免疫系统的功能异常与机体感染、自身免疫性疾病及肿瘤等许多疾病的发生及进展有关。从细胞水平来看,免疫系统由不同的免疫细胞群体(淋巴细胞、单核及巨噬细胞等)及免疫分子(细胞因子、趋化因子等)构成。不同免疫细胞的分化与功能状态是维持正常免疫应答的基础,其分化和功能的异常是导致许多病理性免疫应答的关键因素。巨噬细胞是免疫细胞中的关键群体之一,具有桥联机体天然免疫应答和适应免疫应答的效应,并参与调控炎症、血管新生、组织修复及监视肿瘤侵袭与转移等多种功能。巨噬细胞的功能正常与否通常与其极化表型有关,在多种免疫相关疾病(如自身免疫病、肿瘤等)、动脉粥样硬化等疾病的进展中起关键作用。因此,巨噬细胞功能状态的调控机制研究对于通过靶向巨噬细胞进行免疫干预治疗具有重要的理论意义和应用价值。癌症已成为全球威胁人类健康的头号杀手,寻找有效的治疗靶点和治疗药物是当今生命科学领域的研究热点。在复杂的肿瘤微环境中,肿瘤细胞、间质、血管和淋巴管以及浸润的免疫细胞相互作用,为肿瘤细胞的生存、增殖、迁移和转移提供了有利条件。受微环境的影响,浸润的免疫细胞对肿瘤的杀伤效果受到显著抑制,甚至还会促进肿瘤的生长。巨噬细胞是肿瘤浸润免疫细胞中最常见的细胞群体(约占30-50%),被称为肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAM),多项研究表明其浸润程度与肿瘤预后(prognosis,预测疾病的可能病程和结局)密切相关。巨噬细胞具有可塑性,可通过改变极化状态来适应不同的生理或病理条件。目前,根据免疫功能状态可将其分为“活化的巨噬细胞(classically-activated macrophages,简称M1)”和“可替代活化的巨噬细胞(alternatively-activated macrophages,简称M2)”两种类型,分别发挥“促炎症和杀伤”或“抗炎症和修复”功能。对多种类型肿瘤研究发现,受来源于肿瘤细胞和T淋巴细胞的细胞因子影响,TAM具有M2型极化特点,通过释放II型(抗炎症作用)细胞因子促进肿瘤中血管和淋巴管的形成、增强肿瘤细胞增殖和迁移能力并发挥免疫抑制特性。已证实诱导TAM向M1型转变可有效抑制肿瘤进程。因此,揭示巨噬细胞的内在调控机制,寻找合适的制剂调控其功能,可作为肿瘤治疗的新靶点,对提高当前的肿瘤治疗效果具有重要意义。最新研究理论指出,趋化因子的表达差异是不同表型巨噬细胞的新特点。其中,CCL22作为M2型巨噬细胞来源的标志性趋化因子,在肿瘤微环境中的高表达可导致多种类型的肿瘤患者预后不良,因而受到广泛关注。CCR4是CCL22的受体,在多种肿瘤细胞和部分T淋巴细胞表面均有表达。一方面,M2型巨噬细胞通过CCL22/CCR4趋化轴作用可促进肿瘤细胞的迁移。另一方面,作为免疫反应的核心,部分T淋巴细胞表达CCR4(包括：Th2和调节性T淋巴细胞(regulatory T cell, Treg),均属于CD4+T淋巴细胞)；M2型TAM高表达CCL22导致肿瘤微环境中Th1/Th2比例漂移和Treg细胞大量浸润,通过释放免疫抑制因子,可保护肿瘤细胞逃逸免疫监视和攻击,从而促进肿瘤进展。因此,通过调控M2型巨噬细胞来抑制CCL22/CCR4趋化轴效应,将为靶向巨噬细胞的肿瘤免疫治疗开辟新的途径。化学疗法自20世纪60年代起被广泛应用于肿瘤的临床治疗中。但化疗药物的毒副作用一直是制约新型化疗药物的研发和肿瘤治疗效果的关键。因此,天然药物作为肿瘤治疗药物或化疗药物的佐剂具有极大的应用前景。褐藻多糖(Fucoidan)作为一种天然硫酸多糖化合物,萃取自褐藻细胞壁。多项研究表明,褐藻多糖具有良好的抗肿瘤、抗炎症、降血脂、抗氧化等生物学功能。其中,褐藻多糖的抗肿瘤作用主要表现为抑制肿瘤细胞生长、促进淋巴细胞增殖和抗肿瘤细胞因子分泌等方面,而针对巨噬细胞特别是M2亚型的研究报道极为有限。因此,基于TAM在肿瘤进程中的重要作用,褐藻多糖是否调控巨噬细胞的重编程或因子表达；其可能存在的途径和机制；通过褐藻多糖的调控对巨噬细胞的功能有何影响?是我们关注的主要问题。因此,本课题将分为以下四部分进行研究,以期为天然物质作为抗肿瘤药物的应用和针对TAM的抗肿瘤研究提供新的思路和靶标。一、褐藻多糖对巨噬细胞极化的影响目的:探讨褐藻多糖对巨噬细胞极化方向及极化过程中不同亚型标志性细胞因子表达的影响。方法：采用THP-1单核细胞系,对其分别向M0(未极化状态)、M1和M2型巨噬细胞诱导；在不同诱导过程中分别进行褐藻多糖处理,显微镜观察诱导48 h后巨噬细胞形态学变化；实时定量PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测褐藻多糖对不同亚型标志因子表达的影响。结果：1.褐藻多糖对不同极化方向的巨噬细胞形态无显著影响；2.针对MI型细胞因子,褐藻多糖可显著下调TNF-a在M1型巨噬细胞极化过程中的表达;3.针对M2型细胞因子,褐藻多糖可显著下调TGF-β在M2型巨噬细胞极化过程中的表达。小结：在巨噬细胞极化过程中,褐藻多糖可抑制部分M1和M2型特异细胞因子的表达,但对THP-1来源的巨噬细胞向M1或M2方向的极化无显著影响。二、褐藻多糖对巨噬细胞CC类趋化因子表达的影响目的：研究褐藻多糖对巨噬细胞极化过程中CC类趋化因子的调控作用；探讨CCL22在M2型巨噬细胞中高表达的诱导因素及褐藻多糖的调控作用。方法：1. qRT-PCR检测THP-1来源巨噬细胞极化过程中褐藻多糖对多种巨噬细胞相关CC类趋化因子转录水平的影响；2.从变化显著的M2型相关趋化因子CCL22着手,利用THP-1来源的M2型巨噬细胞模型,采用qRT-PCR和ELISA检测技术,研究M2型诱导因子IL-4和IL-13对其高表达的差异调控,以及褐藻多糖对M2型巨噬细胞CCL22表达和分泌水平的影响；3.采用Ficol密度梯度分离法和CD14磁珠分选技术,分离人外周血中的单核细胞并诱导分化为巨噬细胞,进一步验证褐藻多糖对CCL22的调控作用。结果：1.CC类趋化因子家族中,CCL2和CCL22分别作为M1和M2型巨噬细胞标志性趋化因子,在THP-1来源的MI或M2型巨噬细胞中高表达；2.褐藻多糖可下调部分巨噬细胞相关趋化因子的转录水平,对M2型巨噬细胞极化过程中CCL22的抑制作用尤为显著；3.M2型巨噬细胞诱导因子IL-4对极化后M2型巨噬细胞高表达CCL22起主要作用,1L-13起协同作用,而褐藻多糖起显著抑制作用；4.人外周血单核细胞诱导的M2型巨噬细胞中,CCL22的高表达和胞外分泌水平同样受到褐藻多糖的显著抑制。小结：褐藻多糖可显著抑制IL-4IL-13诱导的M2型巨噬细胞中CCL22的高表达并降低其胞外分泌水平。三、褐藻多糖通过CCL22调节M2型巨噬细细胞对肿瘤和淋巴细胞的趋化作用目的：基于趋化因子CCL22在肿瘤微环境中发挥的重要作用,探究褐藻多糖对M2型巨噬细胞介导的肿瘤细胞及不同亚型T淋巴细胞募集作用的影响。方法：1.选用MHCC-97H人肝癌细胞系,采用Transwell小室检测褐藻多糖作用的M2型巨噬细胞上清对肿瘤细胞迁移的影响；并通过CCL22中和抗体和重组蛋白验证该影响与CCL22水平的相关性；2.利用Transwell、室和流式检测技术分析褐藻多糖作用后的M2型巨噬细胞上清对人外周血来源单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中不同类型(CD4+和CD4-)T淋巴细胞的募集作用；3.采用磁珠分选技术,分离CD4+T淋巴细胞建立细胞迁移模型,流式分析技术检测不同条件上清募集的细胞中CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞所占的比例,验证与褐藻多糖对CCL22表达调控的相关性。结果：1.褐藻多糖或CCL22中和抗体预处理显著抑制M2型巨噬细胞上清对MHCC-97H细胞的迁移作用,加入外源性CCL22可在一定程度上恢复细胞迁移；2.与正常M2型巨噬细胞上清相比,褐藻多糖预处理细胞的上清对CD4+T淋巴细胞的募集比例和数量明显下调；3.对CD4+T淋巴细胞进一步研究发现,褐藻多糖预处理后M2型巨噬细胞上清对Treg细胞的募集作用显著降低,并且与上清中CCL22的水平相关。小结：通过抑制M2型巨噬细胞CCL22的表达、降低胞外分泌水平,褐藻多糖可显著抑制M2型巨噬细胞介导的肿瘤迁移和CD4+T淋巴细胞特别是Treg细胞的募集作用。四、褐藻多糖下调M2型巨噬细胞CCL22的机制研究目的：探讨褐藻多糖对M2型巨噬细胞中CCL22下调作用的胞内调控机制。方法：1. Western Blot检测褐藻多糖对THP-1来源M2型巨噬细胞中AKT、p38-MAPK以及p65-NF-κB磷酸化水平的影响；2.采用相关通路抑制剂进行预处理,通过qRT-PCR和ELIS A检测阻断特异信号通路对CCL22表达和分泌水平的影响；3.采用免疫荧光检测p65-NF-κB核转运,验证褐藻多糖及信号通路抑制剂对转录调控因子NF-κB活性的影响。结果：1.褐藻多糖显著抑制THP-1来源巨噬细胞中PI3K-AKT通路和p65-NF-1 B的转录活性,上调p38-MAPK信号通路；2. PI3K-AKT通路抑制剂Wortmannin可显著上调CCL22的表达和分泌水平,p38-MAPK通路抑制剂SB203580和NF-κB抑制剂BAY 11-7082可显著下调CCL22的表达和分泌水平；3.抑制P13K-AKT通路可促进p38-MAPK的磷酸化并上调p65-NF-κB的磷酸化及核转运,而抑制p38-MAPK通路可抑制AKT的磷酸化并下调p65-NF-KB的磷酸化及核转运。小结：褐藻多糖对转录调控因子NF-κB的抑制作用是下调CCL22表达和胞外分泌水平的关键因素。同时,CCL22表达与p38-MAPK、PI3K-AKT通路也具有一定的相关性。结论：1.本课题从褐藻多糖对巨噬细胞亚型中细胞因子和趋化因子表达谱的调节作用入手,阐述了褐藻多糖对M2型巨噬细胞趋化因子CCL22的表达调控与机制。2.本研究发现并证明了褐藻多糖能通过抑制胞内NF-κB的转录活性显著下调M2型巨噬细胞趋化因子CCL22的表达、降低胞外分泌水平,从而抑制M2型巨噬细胞介导的肿瘤细胞迁移和Treg细胞的募集。3.本研究揭示了褐藻多糖新的抗肿瘤作用机制,对以TAM为靶标的肿瘤免疫治疗提供新思路。第二部分外周血粒淋比作为肿瘤预后指标的影响因素分析研究背景：通过基础、临床和流行病学研究已证实,炎症是肿瘤发生、发展过程中的重要危险因素。天然免疫反应和患者体内炎症的激活,促进了肿瘤的发生和发展。目前,基于外周血检测的相关参数指标,常被用于评估系统的炎症状态,例如：C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)、白蛋白、中性粒细胞数和血小板数等,这些参数在多种中晚期肿瘤的预后评价中具有重要意义。近年来,外周血中性粒细胞和淋巴细胞的比例(简称粒淋比)已被证实是多种类型肿瘤的独立预后评价指标,有时其精确性甚至优于传统的肿瘤分期评估方法,结合其简单易得的优势得到了临床医生和肿瘤研究学者的高度重视。肾脏肿瘤是较为常见的恶性肿瘤之一,其中肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)起源于近曲小管内侧,是肾脏肿瘤中最为常见的亚型。目前对肾细胞癌的治疗手段主要是通过手术进行部分切除或根治切除,但调查显示约30%的肾细胞癌患者在肾脏部分或根治手术后出现复发。因此,随着肿瘤治疗进入“精准医疗”模式,通过预后评价体系对肾细胞癌患者进行评估,对可能复发的肾细胞癌患者的制定有针对性的治疗策略,具有非常重要的指导意义。目前,公认的肾细胞癌预后评价指标由肿瘤相关因素(tumor-related factors)构成,主要包括：肿瘤TNM分期、分级、局部浸润程度、区域淋巴结转移和有无远端转移等。为提高预后评价的准确性,已建立起多种预后评分系统,用于评估肾细胞癌患者的预后。但目前和其他个体相关因素(host-related factors)相同,外周血粒淋比尚未被纳入任何已被认可的肾细胞癌预后评分系统。作为系统炎症指标,外周血粒淋比已被证实和多种临床指标相关。有研究人员证实,外周血粒淋比和高血压呈正相关。而高血压是目前公认的肾细胞癌临床指征之一,也是肾细胞癌的主要诱因之一。因此,本课题以肾细胞癌患者为研究样本,探讨高血压因素对于采用外周血粒淋比进行肾细胞癌预后评估的影响。以期为今后采用外周血粒淋比进行肿瘤预后评估的临床应用提供参考目的：建立肾细胞癌患者术前外周血粒淋比的预后评价标准；分析术前外周血粒淋比和肾细胞癌患者临床参数的相关性；已建立的评价方法分别对有、无高血压的肾细胞癌患者预后评价的差异比较；评估术前外周血粒淋比对于肾细胞癌患者预后评价的应用价值。方法：1.研究对象：建立筛选标准,将401例肾细胞癌初治患者信息纳入研究范围。2.样本信息的提取及处理：对患者病例基本信息、病理信息、外周血检验报告信息和随访信息进行归纳总结。3.外周血粒淋比截断值的获取：将粒淋比指标、随访信息带入截断值分析平台,以时序检验(log-rank test)、ROC曲线和Cox回归模型为分析基础,计算与无复发生存期具有相关性的粒淋比最优截断值。4.统计分析：绘制无复发生存期相关的Kaplan-Meier生存曲线,通过时序检验进行比较分析。临床参数与粒淋比的相关性分析采用Pearso n卡方检验、Fisher精确检验(定性资料)和t检验(定量资料)。对各种临床因素进行生存相关的单因素分析,所有单因素分析中具有相关性的指标,纳入基于Cox回归模型的多因素分析。结果：1.研究样本包含男性276例、女性125例,平均年龄54岁。有高血压病史患者175例,占43.64%。平均随访时间45.5个月,其中复发患者106例,占26.43%,复发平均随访时间为26.4个月。2.粒淋比最佳分析截断值为3.139。低粒淋比组患者的无复发生存期显著高于高粒淋比组。单因素及多因素分析表明,肿瘤大小、T分期、肿瘤组织学分型、粒淋比值可作为肾细胞癌患者独立预后指标,用于评价患者的无复发生存期。3.粒淋比和患者的肾细胞癌组织学分型、肿瘤大小、T、N、M分期、Fuhrman核分级、血小板计数有显著相关性。粒淋比和有、无高血压病史无显著相关性。有、无高血压病史组的粒淋比值无显著性差异。4.对无高血压患者进行分析,低粒淋比组患者的无复发生存期仍显著高于高粒淋比组。单因素和多因素分析表明T分期、肿瘤组织学分型、粒淋比和血小板数可作为无高血压肾细胞癌患者独立预后指标,用于评价患者的无复发生存期。5.对有高血压病史患者进行分析,结果显示高、低粒淋比组患者无复发生存期无显著差异。单因素和多因素分析显示临床T、M分期、肿瘤组织学分型可作为高血压病史肾细胞癌患者的独立预后指标。而粒淋比不能作为独立预后指标评价有高血压病史的肾细胞癌患者预后。结论：通过本研究证实采用肿瘤相关因素评价预后受病理生理学指标的干扰较小。粒淋比作为预后评价指标之前,应当考虑患者是否具有高血压病史。粒淋比等个体相关因素纳入临床预后评价的实际应用具有局限性。提示我们,今后采用粒淋比作为临床预后评价指标的研究过程中,应综合其他病理或生理指标进行系统分析,以提高粒淋比对肿瘤预后的准确性和实用性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-3

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