肺腺癌中lncRNA DLX6-AS1的表达及对生长、侵袭和凋亡的影响

发布时间：2018-10-08 12:36

【摘要】：背景和目的在全球范围内,肺癌是发病率和死亡率均居于首位的恶性肿瘤,每年有160万患者被诊断为肺癌,同时有140余万的患者被肺癌夺取生命,其中80%的肺癌为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。目前治疗NSCLC的常规方法有手术治疗、铂二联化疗、放疗和靶向治疗等,但是这些常规治疗方法对中晚期肿瘤患者来说不能达到治愈的目的,因此,多数患者治疗后生存期仍很短,5年生存率不到15%。由于多数NSCLC患者早期无特异临床表现,在确诊时已至中晚期,多数患者已出现转移和局部侵犯。因此,探讨NSCLC的发病调控机制,早期干预肿瘤细胞的生长、侵袭和迁移能力,有助于提高NSCLC病人的生存率,降低其死亡率。长链非编码RNA(long non-codingRNA,lncRNA)是一类转录本长度大于200核苷酸,不能编码蛋白质的功能性RNA分子。LncRNA参与了生命进程中一系列的重要进程,包括生长发育、骨髓造血、细胞凋亡、细胞增殖等。但是人类对lncRNA在肿瘤中的调控机制却了解很少。已有的研究资料显示许多lncRNA在不同肿瘤组织中的表达发生了改变。因此,其在肿瘤发生、发展过程中的作用备受关注。虽然大多数lncRNA的详细作用机制尚不明确,但lncRNA已成为继mi RNA之后的新的肿瘤研究热点。LncRNA DLX6-AS1定位于7q21.3,查阅国内外文献目前未见其他研究者关于lncRNA DLX6-AS1在肺癌中的报道。为了探索lncRNA DLX6-AS1在肺腺癌细胞的表达、生物学作用及其对肿瘤的调控的初步机制,本课题进行了三个部分的研究。第一部分:肺腺癌组织中lncRNA表达分析;第二部分:下调肺腺癌细胞中lncRNA DLX6-AS1的表达对细胞增殖、凋亡和侵袭的影响;第三部分:lncRNA DLX6-AS1作用机理的初步分析。第一部分肺腺癌组织中lncRNA表达分析方法:1.收集标本,包括72例肺腺癌组织及相对应的癌旁正常组织标本。2.采用lncRNA芯片检测3例肺腺癌组织及相对应的癌旁正常组织标本中lncRNA表达情况,分析差异化表达的lncRNA。3.运用q RT-PCR检测72例样本中lncRNA DLX6-AS1表达水平,分析其表达水平与肺腺癌患者性别、年龄、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况及TNM分期的相关性。结果:1.LncRNA芯片检测分析筛选出18个lncRNAs在肺腺癌组织中表达异常,其中9个lncRNAs表达上调,9个lncRNAs表达下调。LncRNA DLX6-AS1在肺腺癌组织中呈高表达(P0.05)。2.q RT-PCR检测显示在肺腺癌组织,lncRNA DLX6-AS1表达水平较正常组织显著升高(P0.05),lncRNA基因芯片结果和q RT-PCR的结果保持一致,这也说明了基因芯片结果的可靠性。3.肺腺癌组织中lncRNA DLX6-AS1的表达水平与患者的肿瘤分化程度和TNM分期有关(P0.05),而与其性别、年龄、淋巴结转移情况无关(P0.05)。第二部分下调肺腺癌细胞中lncRNA DLX6-AS1的表达对细胞增殖、凋亡和侵袭的影响方法:1.制备和包装沉默lncRNA DLX6-AS1表达的重组慢病毒,感染对数期生长的肺腺癌细胞系A549、H1650,建立下调lncRNA DLX6-AS1表达的肺腺癌细胞株。2.设立三组:实验组(lncRNA DLX6-AS1si RNA慢病毒感染组)、NC组(lncRNA-NC无关序列对照组)和Blank组(空白细胞)。3.CCK-8法、平板克隆形成实验检测三组细胞增殖和生长能力。4.Anncxin V-FITC/PI双标记流式细胞术、Hoechst染色、Caspase-3/7活性检测检测三组细胞凋亡率。5.Western-blot检测细胞中凋亡相关蛋白的表达情况。6.Transwell小室实验、划痕实验检测三组细胞侵袭迁移能力。7.荷瘤小鼠实验检测体内水平沉默lncRNA DLX6-AS1的表达对肺腺癌影响。结果:1.成功制备了重组慢病毒lncRNA DLX6-AS1si RNA和无关序列对照lncRNA DLX6-AS1 NC,慢病毒滴度分别为1.8×108TU/ml和2.3×108TU/ml。对比空白组和无关序列对照组,si Lnc DLX6-AS1组lncRNA DLX6-AS1表达水平显著下调(P0.05)。2.CCK8法检测结果显示在A549和H1650细胞中,si Lnc DLX6-AS1组细胞较空白组和无关序列对照组吸光度显著减少,且随着时间的持续,差异越来越大,差异具有统计学意义(P0.05)。平板克隆形成实验结果显示在A549和H1650细胞中,si Lnc DLX6-AS1组细胞较空白组和无关序列对照组细胞克隆形成数显著降低,差异有统计学意义(P0.05)。3.Anncxin V-FITC/PI双标记流式细胞术和Hoechst染色检测显示在A549和H1650细胞中,si Lnc DLX6-AS1组细胞凋亡率较空白组和无关序列对照组显著升高,对比空白组和无关序列对照组,si Lnc DLX6-AS1组Caspase-3/7细胞活性显著升高,差异具有统计学意义(P0.05)。4.Western blot结果显示在A549和H1650细胞中,si Lnc DLX6-AS1组细胞与空白组和无关序列对照组细胞相比,Cleaved caspase3和Cleaved caspase9蛋白表达水平呈升高状态,而Pro-capase-9与Bcl-2的蛋白表达水平呈明显降低状态,差异具有统计学意义(P0.05)。5.Transwell小室实验结果显示在A549和H1650细胞中,si Lnc DLX6-AS1组细胞与空白组和无关序列对照组细胞相比,穿膜细胞数显著减少,差异有统计学意义(P0.05)。划痕实验显示在A549和H1650细胞中,si Lnc DLX6-AS1组细胞与空白组和无关序列对照组细胞相比,划痕愈合速度明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。6.裸鼠移植瘤体内实验结果显示对比空白组和无关序列对照组,si Lnc DLX6-AS1组移植瘤显著减小,差异有统计学意义(P0.05)。第三部分lncRNA DLX6-AS1作用机理的初步分析方法:1.通过生物信息学分析推测lncRNA DLX6-AS1潜在相互作用的mi RNA。2.构建lncRNA DLX6-AS1野生型和Seed Region突变型表达载体(pc DNA3.1-Wt DLX6 AS1、pc DNA3.1-Mt DLX6 AS1),并转染A549细胞。q RT PCR方法检测转染细胞中lncRNA DLX6-AS1和mi R-497的表达。3.构建报告基因重组载体pmir GLO-Wt3’UTR-Bcl2和pmir GLO-Mt3’UTR-Bcl2。采用双荧光素酶报告实验验证Bcl-2是mi R-497的靶基因及lncRNA DLX6-AS1通过负调控mi R-497调控Bcl-2的表达。4.CCK-8法、Anncxin V-FITC/PI双标记流式细胞术、Transwell小室实验检测上调mi R-497和下调lncRNA DLX6-AS1的表达对肺腺癌细胞的作用。5.构建无3’UTR区Bcl-2的表达载体,单独转入或与mi R-497 mimics共转染入A549细胞或si Lnc DLX6-AS1转染的A549细胞中,通过restore方法分析mi R-429调控Bcl-2表达的作用机制。结果:1.生物信息学分析推测ln RNA DLX6-AS1和mi R-497存在潜在的相互作用的seed region区有特异结合位点。2.LncRNA DLX6-AS1的对A549细胞株中mi R-497的表达起负调控作用,该负调控作用是通过seed region区特异结合而实现的。3.双荧光素酶报告实验显示Bcl-2是mi R-497一个靶基因。4.在A549细胞中过表达mi R-497和沉默lncRNA DLX6-AS1的表达可以起到相似的生物学效应。5.血清饥饿诱导凋亡实验结果显示将不含Bcl-2 3’UTR区的重组载体pc DNA3.1-Bcl2转染至A549细胞后,可以回复上调mi R-497和下调lncRNA DLX6-AS1促进细胞凋亡的能力。结论:1.芯片筛选出18个lncRNAs在肺腺癌组织中表达异常,其中9个lncRNAs表达上调,9个lncRNAs表达下调。LncRNA DLX6-AS1在肺腺癌组织中呈高表达,其表达水平与患者的肿瘤分化程度和TNM分期有关。2.体外下调肺腺癌细胞中的lncRNA DLX6-AS1表达可有效抑制细胞的增殖、降低细胞侵袭迁移能力,并且促进细胞的凋亡。动物实验表明下调lncRNA DLX6-AS1的表达能有效抑制裸鼠移植瘤生长。3.LncRNA DLX6-AS1通过负调控mi R-497调控Bcl-2的表达,从而发挥相应的生物学功能。4.LncRNA DLX6-AS1发挥促癌作用,有望成为肺腺癌治疗新的靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

【相似文献】