胃癌及转移淋巴结中MicroRNA-185表达与肿瘤耐药关系的研究

发布时间：2018-10-09 09:09

【摘要】：目的:胃癌的死亡率占据所有肿瘤死亡率的前三位,其高度恶性及术后各种并发症严重降低了人类的生存质量。微小RNA(MicroRNA)是近年来发现的与基因调控有关的一类小分子非编码单链RNA,参与多种疾病的发生与进展。本课题是以进展期胃癌原发灶肿瘤组织(Primary tumor,PT)以及转移淋巴结组织(Lymph node metastases,LNMs)的新鲜标本以及组织蜡块为研究对象,采用荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)法检测miRNA-185在PT和LNMs中的表达变化及关系;RT-PCR技术和免疫组织化学技术(Immunohistochemistry SP)检测PT和LNMs中胃癌细胞多耐药基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)、谷胱甘肽S-转移酶-π(glutathione S-transferase-π,GST-π)、多耐药相关蛋白-1(multidrug resistance associated protein-1,MRP-1)和胸苷合成酶(thymidylate synthase,TS)的表达变化;四氮唑蓝技术(MTT)测定常用化疗药物(奥沙利铂OXA、长春新碱VCR、氟尿嘧啶5-FU、紫杉醇PTX)对胃癌原发灶癌细胞及相应转移淋巴结细胞的抑制情况,探讨在胃癌原发灶与转移淋巴结中miRNA-185的表达与肿瘤耐药性及耐药基因之间的关系及意义。方法:收集河北医科大学第四医院外三科2014年10月~2015年10月行手术切除的胃癌患者胃癌组织、正常胃黏膜组织和转移淋巴结,共40例患者,淋巴结均由病理科证实转移。采用RT-PCR的方法检测胃癌组织、正常胃黏膜组织和转移淋巴结中miRNA-185的表达情况;采用免疫组化方法检测胃癌组织及转移淋巴结细胞中MDR1/P-gp、GST-π、MRP-1和TS的蛋白表达情况;采用MTT方法检测胃癌化疗常用药物(OXA、VCR、5-FU、PTX)对胃癌原发灶及转移淋巴结细胞体外抑制情况。所有数据均采用SPSS 19.0统计软件处理,P㩳0.05时认为差异具有显著性。结果:1胃癌原发灶、正常胃黏膜组织与转移淋巴结中miRNA-185的表达在正常胃黏膜组织与胃癌组织的表达程度分别为(0.193±0.154)、(0.084±0.131),t=3.752,P㩳0.001,两者差异有统计学意义;在正常胃黏膜与转移淋巴结组织中的表达程度分别为(0.193±0.154)、(0.041±0.050),t=6.605,P0.001,两者差异有统计学意义;在胃癌组织和转移淋巴结中的表达程度分别为(0.084±0.131)、(0.041±0.050),t=2.129,P㩳0.05,两者有统计学差异。由此可以看出miRNA-185在正常组织的表达最高,而在胃癌组织及转移淋巴结中的表达依次降低。2胃癌原发灶与转移淋巴结中miRNA-185表达与P-gp、MRP-1、GST-π、TS蛋白的表达及关系P-gp、MRP-1、GST-π、TS在胃癌原发灶的阳性表达率分别为58.3%(28/48)、62.5%(30/48)、68.8%(33/48)、64.6%(31/48);在转移淋巴结中的阳性表达率分别为79.2%(38/48)、83.3%(40/48)、75.0%(36/48)、85.4%(41/48)。用Pearsonχ~2检验,P-gp、MRP-1、TS在转移淋巴结中的的蛋白表达明显高于原发灶(分别为χ~2=4.210,P=0.042;χ~2=4.370,P=0.038;χ~2=4.140,P=0.030),GST-π在转移淋巴结中的蛋白表达强度高于原发灶,但无明显差异(χ~2=0.840,P=0.483)。双变量相关分析,P-gp、MRP-1、TS的蛋白表达在胃癌原发灶与转移淋巴结之间呈正相关(分别为r=0.448,P=0.006,r=0.349,P=0.048,r=0.267,P=0.031),GST-π在原发灶与转移淋巴结之间未见相关性。在原发灶中,miRNA-185与P-gp、MRP-1、TS蛋白表达呈负相关性,分别为(r=0.457,P=0.026)(r=0.367,P=0.005)(r=0.248,P=0.034),在淋巴结中各变量未见明显相关性。3胃癌原发灶及转移淋巴结细胞对OXA、5-FU、VCR、PTX体外化疗的敏感性比较胃癌原发灶与转移淋巴结细胞中,VCR对转移淋巴结细胞的抑制率要明显低于原发灶(t=3.264,P㩳0.05),而PTX、5-FU、OXA对肿瘤细胞抑制率在胃癌原发灶及转移淋巴结中无统计学差异(P㧐0.05)。在原发灶肿瘤细胞中化疗药物的敏感程度依次为:PTX㧐5-FU㧐VCR㧐OXA;在转移淋巴结细胞中化疗药物敏感程度依次为:PTX㧐5-FU㧐OXA㧐VCR。4胃癌原发灶与转移淋巴结中多耐药基因P-gp、MRP-1、GST-π、TS蛋白的表达与化疗药物抑制率关系胃癌原发灶中,P-gp强表达组5-FU、OXA对肿瘤细胞的抑制率明显低于弱表达组(t=2.467,P㩳0.05;t=2.149,P㩳0.05);MRP-1强表达组5-FU、PTX、VCR对肿瘤细胞的抑制率明显低于弱表达组(t=2.553,P㩳0.05;t=2.837,P㩳0.05;t=2.316,P㩳0.05);GST-π强表达组5-FU、PTX对肿瘤细胞的抑制率要明显低于弱表达组(t=4.627,P㩳0.05;t=3.261,P㩳0.05);TS强表达组5-FU、OXA、PTX对肿瘤细胞的抑制率明显低于若表达组(t=5.163,P㩳0.05;t=2.479,P㩳0.05;t=3.571,P㩳0.05)。在转移淋巴结中,P-gp强表达组PTX、OXA对肿瘤细胞的抑制率明显低于弱表达组(t=5.541,P㩳0.05;t=3.168,P㩳0.05);MRP-1强表达组5-FU、PTX、VCR对肿瘤细胞的抑制率明显低于弱表达组(t=2.261,P㩳0.05;t=2.437,P㩳0.05;t=681,P㩳0.05);GST-π强表达组5-FU、OXA对肿瘤细胞的抑制率要明显低于弱表达组(t=3.529,P㩳0.05;t=3.186,P㩳0.05);TS强表达组5-FU、OXA、VCR对肿瘤细胞的抑制率明显低于若表达组(t=4.943,P㩳0.05;t=2.267,P㩳0.05;t=3.142,P㩳0.05)。结论:本研究采用QRT-PCR技术、细胞培养技术、免疫组织化学技术及MTT法对胃癌原发灶及转移淋巴结细胞中的miRNA-185表达水平、相关耐药蛋白P-gp、MRP-1、GST-π、TS的蛋白表达水平及体外细胞对OXA、5-FU、VCR、PTX药敏性进行实验。并分析其相关性,结论如下:1 miRNA-185在胃癌原发灶及转移淋巴结中的表达均低于正常胃黏膜组织,而在转移淋巴结中的表达又低于原发灶。其表达水平的降低可能是导致胃癌发生的原因,也可能是导致相关耐药蛋白升高从而降低肿瘤细胞药敏性的原因之一。2 通过免疫组化技术证实P-gp、MRP-1、TS在转移淋巴结中的表达强度要高于胃癌原发灶,而GST-π在两者内的表达无统计学差异。3 胃癌原发灶与转移淋巴结细胞中,VCR对转移淋巴结细胞的抑制率要明显低于原发灶(t=3.264,P㩳0.05),而PTX、5-FU、OXA对肿瘤细胞抑制率在胃癌原发灶及转移淋巴结中无统计学差异(P㧐0.05)。在原发灶肿瘤细胞中化疗药物的敏感程度依次为:PTX㧐5-FU㧐VCR㧐OXA;在转移淋巴结细胞中化疗药物敏感程度依次为:PTX㧐5-FU㧐OXA㧐VCR。4 P-gp、MRP-1、GST-π、TS各自的表达程度仅影响部分化疗药物的耐药性,胃癌MDR的评价应该从多途径、多因素进行。综上所述,miRNA-185在肿瘤原发灶与转移淋巴结中的表达下调。对相关耐药蛋白及细胞药敏性的研究也可推断miRNA-185可能是调控多药耐药基因的表达从而使原发灶癌细胞及转移淋巴结细胞产生不同的耐药性。本研究结果提示miRNA-185有可能成为治疗胃癌的新的靶点,但本研究只从其相关性上进行分析,没有进行转染比较等更加直观的科研方法,也没有进行其相关耐药蛋白的m RNA表达水平的检测,且miRNA-185对MDR的具体调控机制尚不完全明确,有待进一步行体内实验及分子间作用机制的研究。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

【参考文献】