TMEM196基因在肺癌中甲基化及功能的初步研究

发布时间：2018-10-09 11:25

【摘要】：背景:肺癌的发病率和死亡率在我国以及世界其它地区的肿瘤性疾病中均排名第一位,已成为目前严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤之一。相比其他的恶性肿瘤,肺癌具有发病率高、死亡率高、不易早期诊断、早期治疗以及治疗手段少等特点,因此目前肺癌患者的5年存活率仍不到15%。近年来的大量研究表明,深入研究肺癌的发生机制,寻找有效的生物标志物用于肺癌的早期诊断是降低肺癌死亡率的重要策略之一。肺癌发生除了与遗传学异常改变相关外,表观遗传学改变在其中的作用越来越受到重视,尤其是DNA甲基化调控在肺癌的发生过程中的作用与机制的研究最为深入,其中抑癌基因通过高甲基化失活广泛参与了肺癌的发生而被认为是较好的肺癌诊断标志物。我们前期通过全基因组筛选新发现一个在肺癌中高甲基化的基因TMEM196基因,通过文献检索发现,目前国内外还未见关于TMEM196基因甲基化在肺癌发生机制中的研究报道,而根据我们前期的实验结果推测TMEM196基因在肿瘤发生过程中可通过高甲基化而失活,是一个候选的抑癌基因,因此有必要通过临床肺癌组织标本进一步证实该基因在肺癌中甲基化的变化和解析该基因在肿瘤发生过程中的作用和功能,为其在临床诊断、治疗以及在其他疾病发生中的作用提供资料。目的:(1)明确TMEM196基因在肺癌细胞和肺癌组织的甲基化发生情况以及与患者临床病理资料之间的关系;(2)明确TMEM196基因甲基化对其表达的影响及调控;(3)分析明确TMEM196基因在肺癌组织的蛋白表达与患者临床病理资料和预后之间的关系;(4)初步分析TMEM196基因在肿瘤发生中的作用。实验方法:(1)采用甲基化特异性PCR结合亚硫酸氢盐修饰测序BSP方法分析检测肺癌细胞和肺癌组织中TMEM196基因的甲基化发生情况;(2)采用逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr)和免疫组织化学染色的方法检测肺癌细胞、肺癌组织和癌旁组织中tmem196基因的表达情况以及去甲基化药物5-aza-dc处理前后肺癌细胞中tmem196基因的表达变化情况;(3)构建tmem196基因高表达和低表达细胞模型,利用cck-8和细胞克隆形成实验等方法,初步分析该基因在肿瘤发生过程中的功能;(4)采用spss17.0统计软件,通过卡方检验分析tmem196基因甲基化或表达与患者临床病理资料之间的相关性,通过kaplan-meier和cox-regression生存分析方法分析tmem196基因表达与患者生存时间之间的关联。实验结果:(1)tmem196基因在10例肺癌肿瘤细胞中均可检测出甲基化,而在正常肺上皮细胞hbe细胞中未检测出甲基化。在肺癌肿瘤组织中其甲基化检出率为61.2%(52/85),而在20例正常肺组织中该基因均未发生甲基化,甲基化发生率为0%,提示tmem196基因甲基化与肺癌的发生明显相关;(2)tmem196基因甲基化与性别、吸烟史、年龄及肺癌病理分型无明显相关性(p0.05),但与肿瘤临床分期以及分化程度密切相关,随着肿瘤分化程度降低,tmem196基因甲基化发生率逐渐升高(p=0.012),在iii期和iv期肺癌患者中tmem196基因甲基化率显著高于i期和ii期患者(p=0.007),提示其甲基化是一个候选的诊断标志物;(3)tmem196基因在9例发生甲基化的肺癌细胞中均出现表达缺失或下降,而在正常肺组织中表达正常,同时在发生甲基化的肺癌组织中的表达也明显下降,而在没有发生甲基化的癌旁组织中的表达较高,表明tmem196基因在肺癌组织中的甲基化也与其表达相关。去甲基化实验证实tmem196基因直接负调控其表达;(4)kaplan-meier单因素分析结果发现,tmem196蛋白高表达的肺癌患者生存时间更长(p0.001)。但在临床i+ii期肺癌患者中,tmem196蛋白高表达患者的生存时间长,而在临床iii+iv期患者中tmem196蛋白表达与患者预后没有显著差别。cox-regression进行了多因素校正分析发现,tmem196基因蛋白表达是一个独立的预后因子(p=0.0003);(5)构建了tmem196高表达的细胞模型,利用细胞增殖实验和克隆形成实验均证实tmem196高表达可以明显抑制肿瘤细胞增殖和克隆形成;而利用rna干扰tmem196基因的表达后,肿瘤细胞增殖达到恢复,这表明在体外tmem196基因可以抑制肿瘤细胞生长,是一个候选的抑癌基因。结论:(1)TMEM196基因的甲基化在肺癌组织和肺癌细胞中普遍发生,而在正常肺组织中未检测到甲基化发生,它们的甲基化发生率存在明显差别,表明TMEM196基因甲基化与肺癌发生密切相关;(2)TMEM196基因甲基化发生率随着肿瘤分化程度降低而逐渐升高,在III期和IV期肺癌患者中TMEM196基因甲基化率显著高于I期和II期患者,是一个候选的诊断标志物;(3)TMEM196基因甲基化直接负调控其表达。在肿瘤组织和肿瘤细胞中,TMEM196基因表达明显下调或者不表达,同时TMEM196蛋白高表达有利于肺癌患者的预后,是肺癌患者的独立预后因素;(4)TMEM196基因在体外能明显抑制肿瘤细胞增殖,是一个候选的抑癌基因。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2

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