FGFR3在软骨发育与稳态维持中的作用与机制研究

发布时间：2018-10-11 08:06

【摘要】：成纤维生长因子受体(FGFR)3作为一个跨膜酪氨酸激酶受体蛋白,在软骨发育的各个阶段发挥着重要作用。多种功能激活性FGFR3突变疾病的患者出现以身材矮小为特征的骨骼发育不良的临床表现,包括软骨发育不全(Achondroplasia,ACH),致死性软骨发育不良(thanatophoric dysplasia,TD I/II),季肋发育不良,严重软骨发育不良伴棘皮症等。相反,功能失活性FGFR3突变会导致屈曲指,高身材和听力丧失(Camptodactyly,tall stature,scoliosis,and hearing loss,CATSHL)综合征。因此,FGFR3被认为在软骨发育中负性调控软骨内成骨,特别是影响了软骨细胞的增殖能力与分化。然而,目前缺乏关于FGFR3在其他软骨相关疾病中的作用以及相关机制的研究。良性软骨肿瘤,特别是外生型软骨瘤(又称为骨软骨瘤)和内生型软骨瘤,是人类最常见的原发性骨肿瘤。大多数软骨肿瘤发生于骨骼发育期,好发于生长板附近,提示软骨肿瘤细胞可能来源于软骨内成骨异常的生长板。此外,多发性软骨肿瘤多见于遗传性疾病,包括遗传性多发性骨软骨瘤病(Hereditary multiple exostoses,HME,又称为骨干连续症),内生性软骨瘤病(Ollier病和Maffucci综合征)和混合性软骨瘤病(Metachondromatosis,MC),这些疾病分别是由EXT1/2,PTHR1或/和IDH1/2和PTPN11基因突变所导致。然而,这些基因所编码的蛋白质均直接或间接与FGFR3信号通路有联系。更重要的是,CATSHL家系中部分成员的长骨也被发现具有骨软骨瘤样的影像学改变。这些证据均提示FGFR3信号可能参与了软骨肿瘤的发生。然而,FGFR3信号在软骨肿瘤发生中的直接作用与相关作用机制目前还不清楚。软骨细胞的终末分化,即软骨肥大化(Hypertrophy),在成年期骨性关节炎(Osteoarthritis,OA)的发生中发挥着关键的作用。通过不同途径抑制关节软骨细胞的肥大化能显著延缓OA的发病进程。我们前期研究发现,表达于生长板软骨增殖带和肥大前带的FGFR3能显著抑制软骨细胞的终末分化。人的关节软骨细胞中也表达FGFR3,并随着OA的发生和发展,FGFR3的表达逐渐降低。这些证据均提示,FGFR3不仅参与早期软骨发育,还可能影响成年期关节软骨的稳态维持。鉴于FGFR3具有抑制软骨细胞肥大化的作用,我们推测FGFR3能保护关节软骨免于退变,并利用基因工程小鼠在关节进行了相关研究加以证明。基于前期研究结果,fgfr3能通过抑制软骨细胞肥大化来保护关节软骨,我们推测激活fgfr3信号通路可能是一种治疗oa的有效途径。fgf9作为fgfr3相对特异的结合配体,它能特异性激活软骨细胞的fgfr3信号通路。创伤后骨性关节炎(post-traumaticosteoarthritis,ptoa)是临床上常见的一种oa类型。通过在小鼠ptoa模型的关节腔内连续局部注射外源性fgf9,我们发现其能显著的保护关节软骨免于退变,然而却促进了关节周围骨赘的生成。研究方法第一部分:1.青年期可诱导条件性敲除软骨细胞的fgfr3:4周龄的同窝fgfr3f/f(cre-negative)及fgfr3f/f;col2a1-creert2(fgfr3cko)小鼠,同时给予1mg/10g/天他莫昔芬(tm)腹腔内注射2次/周直至取材;2.测量小鼠的身长及后肢(股骨及胫骨)的长度,通过x-ray摄像和micro-ct扫描重建,观察小鼠大体形态及骨骼系统的变化情况,通过苏木精/伊红染色法和藏红固绿染色法观察小鼠生长板及软骨肿瘤的组织学结构,通过免疫组织化学染色法研究小鼠生长板及软骨肿瘤中pcna,ki67,collagenx,mmp13,ihh和p-erk的表达情况,通过tunnl检测法研究小鼠生长板软骨细胞凋亡情况;3.利用出生后3-4天的cre-negative和fgfr3cko小鼠膝部的原代软骨细胞,研究fgfr3敲除对软骨相关基因col10,mmp13,adamts5,spp1,ihh和pthrp的表达,蛋白质erk1/2和p-erk1/2的表达及细胞凋亡的影响;4.全身注射ihh信号阻断剂(gdc0449,smoi):4周龄的同窝fgfr3f/f(cre-negative)及fgfr3f/f;col2a1-creert2(fgfr3cko)小鼠,随机分别分为cre-negative+溶剂组,cre-negative+smoi组,fgfr3cko+溶剂组和fgfr3cko+smoi组。cre-negative+smoi组与fgfr3cko+smoi组同时给予1mg/10g/天smoi直至取材,而cre-negative+溶剂组与fgfr3cko+溶剂组同时给予相应计量的smoi溶剂(40%v/w环糊精水溶液)直至取材。5.记录smoi治疗后小鼠的存活情况,测量小鼠的身长及后肢(股骨及胫骨)的长度,通过肉眼,x-ray摄像和micro-ct扫描重建,观察小鼠大体形态及骨骼系统的变化情况;通过苏木精/伊红染色法和藏红固绿染色法观察smoi治疗后小鼠生长板及软骨肿瘤的组织学结构。第二部分:1.成年期可诱导条件性敲除软骨细胞的fgfr3:2月龄的同窝fgfr3f/f(cre-negative)及fgfr3f/f;col2a1-creert2(fgfr3cko)小鼠,同时给予1mg/10g/天他莫昔芬(tm)腹腔内注射连续5天;2.通过x-ray摄像,观察小鼠头颅的大体形态及颞下颌关节的变化情况,通过micro-ct扫描重建,评估fgfr3敲除后小鼠颞下颌关节软骨下骨的变化情况,通过苏木精/伊红染色法和藏红固绿染色法观察小鼠颞下颌关节软骨的组织学结构,通过免疫组织化学染色法研究小鼠颞下颌关节软骨中fgfr3,collagenii,pcna,collagenx,mmp13,adamts5,aggrecan,lubricin,runx2和ihh的表达情况,通过tunnl检测法研究小鼠颞下颌关节的软骨细胞凋亡情况;3.利用3-4周龄cre-negative和fgfr3cko小鼠颞下颌关节的原代软骨细胞,研究fgfr3敲除对软骨相关基因col10,mmp13,adamts5,gli1和runx2的表达;4.全身注射smoi:2月龄的同窝fgfr3f/f(cre-negative)及fgfr3f/f;col2a1-creert2(fgfr3cko)小鼠,随机分别分为cre-negative+溶剂组,cre-negative+smoi组,fgfr3cko+溶剂组和fgfr3cko+smoi组。cre-negative+smoi组与fgfr3cko+smoi组同时给予1mg/10g/天smoi直至取材,而cre-negative+溶剂组与fgfr3cko+溶剂组同时给予相应计量的smoi溶剂(40%v/w环糊精水溶液)直至取材。5.通过苏木精/伊红染色法和藏红固绿染色法观察smoi治疗后小鼠颞下颌关节软骨的组织学结构,通过免疫组织化学染色法观察smoi治疗后小鼠颞下颌关节软骨中lubricin的表达情况。第三部分:1.通过免疫组织化学染色法观察小鼠健康与ptoa关节软骨细胞中fgf9的表达情况;2.建立人全层关节软骨培养模型:将培养的人全层关节软骨块随机分为空白组,fgf9组,白介素-1β(interleukin-1β,il-1β)组和il-1+fgf9组,通过藏红固绿染色法观察其组织学结构,通过免疫组织化学染色法研究其中collagenii,collagenx和mmp13的表达情况;3.将人原代软骨细胞随机分4个组,分别为空白组,fgf9组,il-1β组和il-1+fgf9组,检测其中aggrecan和mmp13的蛋白表达变化;4.建立手术诱导的ptoa模型:内侧半月板不稳定(destabilizationofthemedialmeniscus,dmm)模型。dmm手术即是在体视显微镜下手术切除小鼠内侧半月板胫骨韧带,造成关节不稳定从而导致膝关节软骨磨损。对同窝雄性c3h背景的野生型小鼠右侧膝关节进行dmm手术,并对左侧膝关节进行假手术(切开关节腔后即缝合)。5.膝关节内局部注射fgf9:将小鼠膝关节随机分成4个组,分别是假手术+盐水组,假手术+fgf9组,dmm+盐水组和dmm+fgf9组。dmm手术和假手术后的第二周,对相应分组小鼠膝关节分别注射5μlfgf9(浓度为5μl生理盐水加入1μgfgf9)与5μl生理盐水。随后,2次/周注射相应试剂直至取材。6.通过micro-ct扫描重建,评估fgf9关节内局部注射后小鼠膝关节软骨下骨的变化情况,通过藏红固绿染色法和阿尔新蓝/苏木精/伊红染色法观察fgf9关节内局部注射后小鼠膝关节组织学结构变化。通过oarsi(osteoarthritisresearchsocietyinternational)推荐方法对其关节软骨基质丢失和损伤情况进行评分,通过免疫组织化学染色法检测小鼠膝关节软骨中collagenii,collagenx,mmp13和cleavedcaspase-3的表达情况,以及在骨赘形成处collagenii,pcna和sox9的表达情况。实验结果:1.软骨细胞内特异性fgfr3功能失活能直接导致混合性软骨瘤样改变1.青春期软骨细胞内特异性fgfr3功能失活导致小鼠身长和后肢长度明显增加,并且全身多处出现软骨肿瘤样占位。组织学切片染色发现小鼠生长板增宽,软骨细胞排列紊乱,骨髓腔内出现内生型软骨瘤样占位,骨皮质出现外生型软骨瘤(骨软骨瘤,外生型骨疣)样占位等;2.软骨细胞内特异性fgfr3功能失活导致小鼠生长板软骨细胞极性紊乱,增殖活性增强,分化加快以及凋亡降低等;3.软骨细胞内特异性fgfr3功能失活下调软骨细胞的erk1/2的磷酸化,并促进其ihh/pthrp的表达;4.通过全身系统注射ihh信号阻断剂能显著抑制小鼠软骨细胞内特异性fgfr3功能失活所导致的混合性软骨瘤样改变的发生。2.fgfr3参与成年期颞下颌关节软骨的稳态维持1.成年期软骨细胞内特异性fgfr3功能失活对小鼠颞下颌关节的大体形态未见明显的影响;然而,fgfr3cko小鼠的颞下颌关节软骨出现明显oa的变化,包括软骨细胞减少,基质丢失和软骨表面裂隙等;2.成年期软骨细胞内特异性fgfr3功能失活导致小鼠颞下颌关节软骨collagenx,mmp13和adamts5的表达明显升高,而aggrecan和lubricin的表达明显下降;此外,tunel阳性细胞明显增多,颞下颌关节软骨下骨出现明显骨量增多;然而,pcna的表达未见明显的变化;3.成年期软骨细胞内特异性FGFR3功能失活的导致小鼠颞下颌关节软骨中IHH和RUNX2表达明显升高;在颞下颌关节原代软骨细胞中,IHH信号阻断剂(SMOi)能显著降低由FGFR3功能失活导致的Runx2,Col10,Mmp13和Adamts5高表达;4.通过全身系统注射SMOi能显著抑制成年期小鼠软骨细胞内特异性FGFR3功能失活所导致的颞下颌关节OA的发生。三、关节腔内注射外源性FGF9能明显缓解DMM手术所导致的PTOA1.DMM后小鼠关节软骨的FGF9表达明显下降;2.关节腔内注射外源性FGF9能明显缓解DMM手术所导致的关节软骨基质丢失,Collagen X和MMP13的表达升高等;同时,在人关节软骨组织培养模型中,外源性FGF9能显著缓解IL-1β刺激所导致的软骨基质丢失,Collagen X和MMP13的表达升高等;3.关节腔内注射外源性FGF9会导致DMM手术所致的小鼠关节骨赘明显变大;4.关节腔内注射外源性FGF9能明显上调DMM手术所导致的关节骨赘处细胞PCNA,SOX9和Collagen II的表达。结论:一、青年期软骨细胞内FGFR3功能失活能通过上调IHH信号直接导致混合性软骨肿瘤的发生;二、成年期软骨细胞内FGFR3功能失活能通过上调IHH/RUNX2信号通路导致颞下颌关节OA发生;三、关节腔内注射外源性FGF9能保护PTOA中的软骨细胞免于退变,同时促进骨赘的生成。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738.3

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