应用WT1抗原肽体外剌激培养DC-CIK细胞杀伤K562细胞实验研究

发布时间：2018-10-12 09:16

【摘要】：目的:以WT1基因阳性的患者为研究对象,提取其外周血单个核细胞,体外诱导产生树突状细胞(DC),负载WT1复合抗原肽,体外诱导产生细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK),检测DC细胞与CIK细胞的增殖能力、免疫表型变化,并检测DC-CIK混合培养后对WT1基因阳性K562细胞的杀伤作用,探索收获WT1抗原特异性效应细胞的合理途径。方法:DC细胞的培养:抽取WT1阳性白血病患者经肝素抗凝后的外周血,经肝素抗凝后,用淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞(MNC,mononuclear cells)。然后用RPMI 1640培养液将细胞浓度调整至5×106/ml,孵育4小时后,提取贴壁细胞,调整细胞浓度为5×106/ml加入6孔培养板中,并加入细胞因子,使得重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rh GM-CSF)浓度为1000U/ml、重组人白细胞介素-4(rh IL-4)浓度为1000 U/ml。第5天加入WTI混合抗原肽50ng/ml,实验组DC细胞负载WTI混合抗原肽,对照组DC细胞不负载WT1抗原肽,第6天,两组加重组人肿瘤坏死因子-a(rh TNF-a),使浓度为1000U/ml,促进DC细胞成熟。CIK细胞的体外培养:同上来源的细胞经过单个核细胞的分离,孵育4小时后,收集悬浮的细胞,将细胞浓度调整至1×106/ml,加入干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)1000U/ml,24小时后加入CD-3单抗(CD-3 monoclonal antibody)50ng/ml,重组人白细胞介素-2(rh-interleukin-2,rh IL-2)500U/ml,以后隔日更换新的培养液并计数,同时补充加入rh IL-2。培育第7天,用台盼蓝排斥法染色DC细胞和CIK细胞,计数活细胞,用完全培养基(含10%胎牛血清的RPMI1640液)调整DC细胞浓度为1×106/ml,CIK细胞浓度为5×106/ml,按照l:5比例混合,继续培养,在共培养的第1天、第3天、第7天收集共培养细胞,计数,应用流式细胞术检测其免疫分子标记,并检测其对靶细胞的杀伤活性。结果:1负载WT1抗原肽组与未负载WT1抗原肽组来源的DC-CIK细胞增殖能力的比较在温箱中孵育过的贴壁单个核细胞,经过GM-CSF和IL-4诱导后成树突状细胞,倒置显微镜下观察细胞形态,培育中细胞外形发生变化,细胞量亦有增加。培育48小时后细胞体积较前增大,表面有毛刺样突起,随着培育时间的增长,细胞体积明显增大,细胞边缘毛刺样突起增多,变长(见Fig.1)。悬浮单个核细胞在相应细胞因子的诱导下扩增成CIK细胞,并逐渐形成细胞团;CIK细胞最初,散在均匀分布,个小,亮而圆(见Fig.2)。在培养的第3天,细胞形态开始呈现出不规则变化,并呈细胞团样生长(见Fig.3)。从培养的第6天起,细胞明显增殖,成丛或以集落状态生长,并悬浮于培养基中(见Fig.4)。随着培养时间增长,细胞集落数逐渐增多。经台盼蓝排斥法对活细胞进行计数,第7天,负载WT1抗原肽组DC-CIK细胞的增殖倍数为(10.01±0.71)倍,未负载WT1抗原肽组DC-CIK增生了(10.20±0.60)倍;第14天,负载WT1抗原肽组DC-CIK细胞数为原来的(17.16±0.93)倍,未负载WT1抗原肽组是原来的(17.40±0.94)倍(见Table 1)。分析比较同一组细胞的增殖倍数随时间的增加均有统计学意义,但两组之间没有统计学差异,以上结果说明,是否负荷肿瘤抗原肽对DC-CIK的增殖没有显著影响。2负载WT1抗原肽组与未负载WT1抗原肽组的DC-CIK分子免疫表型的变化分别收集培养第1天、7天及14天的两组培养细胞,通过流式细胞仪检测细胞分子免疫表型的变化。结果显示:当天测得白血病患者细胞的分子免疫表型结果如下:CD3+CD8+细胞为(30.34±3.14)%,CD3+CD56+细胞为(5.49±0.45)%。细胞培养的第7天、14天免疫表型检测结果如下:负载WT1抗原肽组CD3+CD8+细胞为(40.25±2.66)%,(76.48±4.08)%,CD3+CD56+细胞为(9.48±1.06)%,(29.11±4.27)%;未WT1负载抗原肽组CD3+CD8+细胞为(39.61±2.51)%,(75.61±6.27)%,CD3+CD56+细胞为(9.44±1.10)%,(29.11±4.91)%(见Table 2),在DC-CIK细胞的培养过程中,随着培养时间的增长,负载WT1抗原肽组与未负载WT1抗原肽组来源DC-CIK细胞,其CD3+CD8+及CD3+CD56+双阳性细胞比例均有显著提高,但两组无显著性差异,即P0.05,以上数据说明是否负荷抗原肽对诱导出的DC-CIK细胞的表型没有影响。3负载WT1抗原肽组与未负载WT1抗原肽组来源DC-CIK细胞杀伤活性比较采集培养14天的DC-CIK细胞做杀伤实验,收集培养的负载WT1抗原肽组DC-CIK细胞作为效应细胞,分别以WT1基因(+)的K562细胞和WT1基因(-)的HL60细胞为靶细胞,在效靶比5:1~20:1范围内,比较两者的杀伤活性。负载WT1抗原肽组DC-CIK在效靶比分别为5:1,10:1,20:1时对K562细胞的杀伤活性结果为(49.21±4.78)%,(74.86±1.55)%,(83.01±2.35)%,同时检测在相应效靶比下,对HL60细胞的杀伤为(39.18±1.96)%,(60.44±2.79)%,(69.56±1.45)%(见Table 3),经过统计学分析,相同效靶比条件下二者的杀伤力有显著性差异。收集培养的未负载WT1抗原肽组DC-CIK细胞作为效应细胞,分别以WT1基因(+)的K562细胞和WT1基因(-)的HL60细胞为靶细胞,在效靶比5:1~20:1范围内,比较两者的杀伤活性。负载WT1抗原肽组DC-CIK在效靶比分别为5:1,10:1,20:1时对K562细胞的杀伤活性结果为(38.95±2.03)%,(59.48±3.97)%,(69.19±1.52)%,同时检测在相应效靶比下,对HL60细胞的杀伤为(39.95±1.45)%,(60.88±1.30)%,(70.08±1.07)%(见Table 4),经过统计学分析,相同效靶比条件下二者的杀伤力无差异。以上数据说明负载WT1抗原肽组和未负载WT1抗原肽组来源DC-CIK细胞对WT1基因(-)的HL60细胞均有杀伤作用,两组无统计学意义。两组对WT1(+)的K562细胞的杀伤,负载WT1抗原肽组明显强于未负载WT1抗原肽组,两组差异有统计学意义,说明负载WT1抗原肽组来源的DC-CIK细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。结论:1应用白血病患者的外周血单个核细胞通过负荷抗原的的培养方法可培养出DC-CIK细胞,且具有杀伤活性。2负载WT1抗原肽组与未负载WT1抗原肽组来源DC-CIK细胞,其CD3+CD8+及CD3+CD56+双阳性细胞比例均有显著提高,两组无显著性差异。3负载WT1抗原肽组和未负载WT1抗原肽组来源DC-CIK细胞对WT1基因(-)的HL60细胞均有杀伤作用,两组无统计学意义。4两组对WT1(+)的K562细胞的杀伤,负载WT1抗原肽组明显强于未负载WT1抗原肽组,两组差异有统计学意义,说明负载WT1抗原肽组来源的DC-CIK细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.7

【参考文献】