胃癌中异常HIF-1α相关调控网络的分析及HIF-1α对胃癌细胞生物学行为的影响

发布时间：2018-10-12 11:03

【摘要】：胃癌的发病与进展是多基因参与、多步骤相关的复杂过程，最终使细胞的正常生物学行为向恶性细胞转变。单一分子（基因/蛋白质）的研究往往是片面的，系统、全面的检测胃癌中的基因变化有助于无遗漏的探索胃癌相关的基因改变机制。在转录组(Transcriptome)层面进行分析，人类基因组被转录生成mRNA分子，检测细胞或组织中转录组mRNA表达情况有助于准确地了解生命体全局的基因表达信息，，还能够为疾病的诊断提供系统的分子机制。生命体由分子(DNA、RNA、蛋白等)之间互相作用、彼此调控与被调控的动态体系构成，分析基因之间的调控网络对研究机体的生理及病理状态尤为关键，而转录组层面的基因表达数据便为此提供了丰富的数据信息。在生命体全局的基因调控领域，转录因子(transcription factor，TFs)扮演着至关重要的角色，是真核生物中调节基因表达的主要调控因子。不同的转录因子之间也存在着调控与被调控关系，这种普遍的协同调控维持了基因组相对稳定的表达活性。一些关键转录因子的功能失调导致其靶基因表达异常，促进了疾病如癌症的发生及进展。缺氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor-1alpha, HIF-1α,也称低氧诱导因子1α)是参与低氧环境下细胞适应性调节的核心转录因子。HIF-1α的靶基因众多，在血管生成、细胞的侵袭和转移、细胞增殖等肿瘤相关特性方面发挥了重要的调控作用。研究表明HIF-1α在胃癌中呈表达活跃状态，但多数倾向于探讨HIF-1α和/或其特定一个/数个靶基因对胃癌的影响，鲜有对胃癌中HIF-1α相关的系统基因调控网络的研究报道。鉴于此，本研究旨在系统、全面的解析胃癌中与HIF-1α相关的转录调控网络的表达模式，并进一步探讨干预HIF-1α表达后对胃癌细胞株生物学行为的影响。研究运用Affymetrix基因表达谱芯片，筛选出了胃癌组织中的差异基因表达谱；整合转录调控元件数据库TRED (Transcriptional Regulatory Element Database)信息，构建了胃癌组织中存在着差异调控的HIF-1α相关转录调控网络；在细胞层面进行siRNA干扰HIF-1α表达，观察HIF-1α对胃癌细胞SGC-7901增殖、凋亡及细胞周期等生物学行为的影响。具体工作报告如下： 1、胃癌组织差异基因表达谱的分析为了分析胃癌组织基因组的mRNA表达情况，实验以5对胃癌及相应的癌旁组织（视为正常组）为研究对象，运用Affymetrix外显子芯片(Affymetrix GeneChip HumanExon1.0ST)检测组织样本中的基因探针峰度值，基于Limma算法对癌症vs.正常组织进行差异基因筛选，共得到胃癌组织中存在着2547个差异基因(fold change2, P 0.05, FDR 0.05)，其中2422个基因表达上调，125个基因表达下调。以差异基因为研究对象，进行功能显著性分析(Gene Oocology-Analysis)，得到差异基因所显著影响的功能条目，包含102个显著上调的GO-Term (P 0.01)和11个显著下调的GO-Term (P0.01)。基于差异基因做了信号通路分析(Pathway-Analysis)，得到43个显著上调的Pathway-Term (P 0.01)和5个显著下调的Pathway-Term (P 0.05)。此部分研究为寻找胃癌相关致病基因提供了数据信息及理论依据。 2、胃癌组织中异常的HIF-1α相关转录调控网络的构建及分析以胃癌组织差异基因表达谱为数据基础，整合TRED转录调控元件数据库，我们构建了胃癌中存在着表达失调的HIF-1α相关转录调控网络。该基因调控网络以转录因子HIF-1α NF-κB1BRCA1STAT3STAT1为调控支架，包含着82个基因（转录因子在内）共组成了95种调控方式，其中79个基因表达上调，3个基因表达下调。DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)疾病关联分析显示网络中82个基因分别与癌症、炎症、心血管疾病、免疫系统疾病显著相关(P 0.01)。网络中7个基因受到了两个及两个以上转录因子的同时调控，称为枢纽基因，包括MMP1、TIMP1、TLR2、FCGR3A、IRF1、FAS、TFF3。Real-time PCR及western blot进一步检测10对胃癌及相应癌旁组织中基因表达，显示HIF-1α及其靶基因TFF3、TIMP1在胃癌组织中mRNA相对表达量分别为为癌旁组织的2.55±0.56(P 0.05)、2.16±0.59(P 0.05)、1.58±0.25(P 0.05)倍，HIF-1α蛋白相对表达量在胃癌组织明显高于癌旁组织，提示结果与芯片结果趋势相同。 3、HIF-1α对胃癌细胞生物行为学的影响为了探索HIF-1α对胃癌细胞生物学行为的影响，研究对胃癌细胞株SGC-7901进行了HIF-1α-siRNA干扰HIF-1α在细胞中的表达。筛选出了沉默HIF-1α表达有效的HIF-1α-siRNA序列。进一步检测转染HIF-1α-siRNA对SGC-7901细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。结果显示与空白组相比，转染HIF-1α-siRNA能抑制SGC-7901细胞增殖，在转染24h、48h的抑制率分别为(29.30±5.78)%(P 0.05)与(23.39±4.36)%(P0.05)；转染HIF-1α-siRNA能诱导SGC-7901细胞凋亡，表现为显著增加早期凋亡细胞百分比(P 0.05)和晚期凋亡细胞百分比(P 0.05)；转染HIF-1α-siRNA能改变SGC-7901细胞周期进程，表现为明显升高了所处G2/M期的细胞百分比。以上结果显示HIF-1α-siRNA沉默HIF-1α表达有助于抑制胃癌细胞的生长，提示HIF-1α在胃癌的进展过程中发挥了促癌作用，干预HIF-1α表达对控制胃癌有利。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2

【参考文献】