MAP4K4在调控肺腺癌生长、转移中的作用及机制研究

发布时间：2018-10-12 15:52

【摘要】：背景:目前,肺癌仍然是世界范围内致死率最高的恶性肿瘤,其生物学行为及调控机制繁复庞杂,现代医学远没有清楚认识这种极端致命的疾病,因此继续深入研究肺癌的发生、进展机制有重要的科学意义。肺腺癌占肺癌总发病数的38.5%,是最常见的肺癌类型。研究表明,76%肺腺癌患者有RTK/RAS/RAF通路的激活型突变,导致下游MAPK通路的持续激活。由于RTK/RAS/RAF/MAPK通路对肺癌发生、进展起至关重要的调控作用,这条肺癌细胞的“生命线”成为分子靶向药物研究的焦点。然而,尽管针对这条通路上多个分子的靶向治疗使一部分患者受益,但是由于耐药、药物毒性反应、制药技术手段的限制等,临床仍然迫切需要更有效地抑制RTK/RAS/RAF/MAPK通路信号转导的治疗手段。另外,有研究表明,许多没有RTK/RAS/RAF通路突变的肺腺癌患者仍存在MAPK通路的显著激活,提示未被清楚认知的MAPK通路上游调控分子的存在。因此,对MAPK通路调控机制更深入的研究可能为寻找新的治疗靶点和策略提供线索。MAP4K4是一种丝/苏氨酸激酶,由于其对MAPK通路中MAP3K分子的磷酸化作用而得名。MAP4K4作为炎症反应相关激酶在糖尿病、动脉粥样硬化等系统性炎症性疾病中被广泛研究。MAP4K4对MAPK/JNK、MAPK/ERK、MAPK/p38的调控作用均可见文献报道,而其对下游分子的选择性因生物学系统和疾病进展阶段不同而异。MAP4K4在肿瘤发生、进展中的作用及机制研究较少。有研究表明,MAP4K4在肺腺癌患者肿瘤组织中高表达,且与患者不良预后相关,然而其对肺腺癌细胞功能的调控作用及机制未见文献报道。我们推测,MAP4K4可能通过调控MAPK通路维系肺腺癌细胞的恶性表型,促进肺腺癌的生长和转移。有研究表明,应用si RNA抑制巨噬细胞MAP4K4的表达能够有效逆转系统性炎症,MAP4K4小分子抑制剂能抑制动脉粥样硬化的发生,提示MAP4K4作为分子治疗靶点的可能性。深入研究MAP4K4在肺腺癌发生、进展中的作用及机制可能为肺腺癌治疗提供新的抑制MAPK通路的分子靶点,为改进肺腺癌治疗策略提供科学依据。目的:1、研究MAP4K4在肺腺癌患者肿瘤组织中的表达情况,及其与患者EGFR、KRAS突变状况的相关性。2、研究MAP4K4在体内、外对肺腺癌细胞生长、增殖、迁移及侵袭功能的调控作用。3、初步阐释MAP4K4调控肺腺癌细胞功能的分子机制。方法:1、对肺腺癌组织芯片进行MAP4K4免疫组织化学染色,一方面比较肿瘤组织与癌旁组织及正常肺组织MAP4K4表达的差异,一方面结合患者EGFR、KRAS突变背景,分析MAP4K4在肺腺癌患者肿瘤组织中表达情况与基因突变状态的关系。2、应用EGFR突变、KRAS突变及EGFR和KRAS野生型的肺腺癌细胞株作为体外研究的细胞模型,应用sh RNA转染、小分子抑制剂处理及过表达质粒转染的方法抑制或上调肺腺癌细胞中MAP4K4的表达,应用MTT细胞增殖实验、软琼脂克隆形成实验、划痕实验、体外侵袭实验检测MAP4K4表达变化对细胞功能的影响;建立裸鼠皮下移植瘤和尾静脉注射肺转移模型,体内验证MAP4K4对肺腺癌细胞功能的影响。3、抑制或上调肺腺癌细胞中MAP4K4的表达后,应用免疫印记技术、RAS活性实验检测MAPK通路的分子变化、RAS活性变化,应用质粒转染加回实验进一步确认MAP4K4对下游分子的调控作用及其对细胞功能的影响;应用磷酸酶活性实验检测肺腺癌细胞中MAP4K4表达改变后MAPK负反馈调节通路中磷酸酶的活性。结果:1、免疫组织化学方法在肺腺癌患者癌旁组织及正常肺组织中检测不到MAP4K4的表达,在肿瘤组织中MAP4K4高表达,而且其高表达与患者EGFR、KRAS突变情况无关。2、sh RNA或小分子抑制剂抑制各基因背景肺腺癌细胞MAP4K4的表达能够抑制细胞增殖、软琼脂克隆形成、体外迁移和侵袭功能,而且sh RNA抑制MAP4K4表达能够抑制EGF诱导的H1793(EGFR和KRAS野生型)细胞的增殖。3、MAP4K4通过抑制PP2A活性促进p-ERK1/2的表达,且MAP4K4对ERK1/2的激活作用不依赖于EGFR、RAS、MEK的激活。4、sh RNA抑制MAP4K4的表达能够显著抑制肺腺癌细胞在裸鼠体内的皮下成瘤能力和肺转移能力,且该作用通过抑制p-ERK1/2的表达而实现。结论:MAP4K4通过抑制PP2A活性促进ERK1/2的活化,从而促进肺腺癌细胞恶性表型的维系,促进细胞在体内的生长、转移,而且这种作用不依赖于EGFR、RAS、MEK的激活,提示MAP4K4可能是新的MAPK/ERK上游调控分子,且MAP4K4/ERK1/2轴可能是EGFR/KRAS/RAF/MEK/ERK的旁路信号转导途径,提示MAP4K4可能是肺腺癌新的分子治疗靶点。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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