miR-21在胃癌中的表达及其介导阿霉素耐药中作用机制研究

发布时间：2018-10-13 09:13

【摘要】：micro RNA(以下简称mi RNA)是一类长度为19~25个核苷酸的内源非编码小分子RNA,它通过与靶基因m RNA的3‘-非编码区(3‘-untranslated region,3’-UTR)特异结合在转录后水平导致基因沉默。近年来发现mi RNA在肿瘤中发挥“促癌”和“抑癌”的作用而影响肿瘤的发生、发展及预后。阐明mi RNA的功能及具体作用机制,并将它们整合到整个表达调控网络中是近几年来基础医学研究的热点。我国每年胃癌新发病例约40万例,是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一。目前唯一证实的可能治愈胃癌的手段就是手术治疗,但是仍有部分患者在术后转移或复发,因此控制胃癌的复发或转移及晚期胃癌患者的综合性治疗都需要化疗的手段来协助实现。然而化疗过程中的关键棘手的问题就是耐药的出现。因此寻找高效灵敏的分子标志物、阐明胃癌多药耐药的分子机制、并探索逆转耐药的药物靶点成为肿瘤研究领域的一个重要方向。近几年发现mi RNA在胃癌的发生发展及多药耐药过程中也起着重要的作用。mi R-21是目前发现的唯一一个在多种恶性肿瘤中都表现出“癌基因”特性的mi RNA,抑制其表达可以促进肿瘤细胞凋亡并抑制肿瘤细胞的恶性增殖。已有研究表明,mi R-21与胰腺癌、胆管细胞癌、乳腺癌等恶性肿瘤的耐药相关,但是mi R-21与胃癌化疗耐药的相关研究还少见报道。为进一步探索mi R-21在胃癌耐药方面的功能及调控机制,我们对mi R-21在胃癌的表达、介导耐药中的功能以及其下游的靶基因进行了研究,以期为临床上胃癌化疗耐药的研究提供新的靶点。简述如下。目的:探讨mi R-21在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达差异,并明确其表达与胃癌临床病理参数及预后的相关性;研究mi R-21在胃癌耐药细胞中的作用和调控机制。方法:(1)收集以下标本和随访资料(46例初发胃癌患者手术切除标本及其癌旁组织),QRT-PCR检测mi R-21在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达, Mann-Whitney U检验和one-way ANOVA的统计方法研究miR-21的表达水平与胃癌各项临床特征及预后的相关性。(2)采用浓度梯度递增法和间歇诱导法成功建立诱导建立胃癌阿霉素耐药细胞株SGC7901/DOX3,在此基础上,检测耐药细胞SGC7901/DOX3与亲本细胞株SGC7901中mi R-21的表达。利用脂质体Lipofectamine 3000将成熟mi R-21的模拟物mimics(mi R-21)、阻遏物inhibitors(anti-mi R-21)及相应的阴性对照negative control RNA(mi R-NC和anti-mi R-NC)转染至SGC7901和SGC7901/DDP细胞;real-time PCR技术验证转染效率;CCK-8法检测细胞增殖水平;AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术和Western Blot检测细胞凋亡率;PI流式细胞术检测细胞周期。(3)靶基因进行预测和筛选采用多个应用生物信息学软件进行,靶基因实验验证采用双荧光素酶报告法和Western Blot完成。并在临床样本中验证所筛选出的靶基因的表达,分析其与mi R-21的相关性。(4)定量PCR和Western blot法分别检测SGC7901/DOX3与SGC7901细胞间PTEN和TIMP3 m RNA和蛋白表达差异,CCK-8法、AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术和Western Blot分别检测细胞转染干扰PTEN和TIMP3对胃癌细胞增殖凋亡的影响。结果:(1)mi R-21在初发和复发的胃癌患者癌组织中的表达水平均显著高于相应的癌旁正常组织(P0.05),且复发的胃癌患者癌组织中比初发患者中更高(P0.05)。临床病理特征研究发现,mi R-21与胃癌组织分化程度(P=0.017)、临床分期(P=0.047)及是否有淋巴结转移(P=0.013)等临床特征有关。(2)与SGC7901细胞相比,mi R-21在SGC7901/DOX3中表达增高8.5±0.887倍,差异有统计学意义(P0.01)。而且随着耐药浓度的提高mi R-21的表达逐步上升,暗示了mi R-21表达可能与胃癌细胞耐药相关。在SGC7901/DOX3中转染anti-mi R-21能逆转其对阿霉素的耐药性。anti-mi R-21组对阿霉素的IC50为4.476±0.014μg/m L,与anti-mi R-NC组(23.085±0.0639μg/m L)相比,有显著性差异(P0.01)。而且,SGC7901/DOX3细胞转染anti-mi R-21和anti-mi R-NC 24h后加入终浓度为5.0μg/m L阿霉素培养48h后,anti-mi R-21组的凋亡率明显增加。同样,在SGC7901中转染mi R-21后能明显增加敏感株对阿霉素的耐药性。mi R-21组对阿霉素的IC50为9.236±0.024μg/m L,与mi R-NC组(0.775±0.074μg/m L)相比,有显著性差异(P0.01)。SGC7901细胞转染mi R-21mimics或mi R-NC 24h后加入终浓度为0.8μg/m L阿霉素培养48h后,过表达mi R-21组凋亡率明显减少,与NC组相比有明显差异(P0.05)。(3)软件预测和双荧光报告实验筛选出mi R-21在胃癌细胞中的靶基因-PTEN和TIMP3。SGC7901细胞转染mi R-21mimics后,PTEN和TIMP3的m RNA和蛋白均降低。SGC7901/DOX3细胞转染anti-mi R-21后,其细胞内PTEN和TIMP3的m RNA和蛋白的表达较亲本细胞SGC7901明显更高。在胃癌组织中,PTEN和TIMP3与mi R-21的水平呈负相关关系。(4)SGC7901/DOX3细胞系中PTEN和TIMP3的m RNA和蛋白的表达较亲本细胞SGC7901明显减低(P0.01)。在SGC7901中转染si-PTEN或si-TIMP3后能增强其对阿霉素的耐药性。si-PTEN和si-TIMP3组对阿霉素的IC50分别为20.22±0.039μg/m L、18.51±0.056μg/m L,与si-NC组(4.49±0.032μg/m L)相比,有显著性差异(P0.01)。结论:本论文的研究工作检测了mi R-21、PTEN及TIMP3在胃癌患者中的表达水平,阐明了高表达mi R-21与临床特征及预后相关性,揭示了mi R-21参与胃癌耐药的新机制,证明了高表达mi R-21能够通过靶向PTEN及TIMP3而改变细胞周期时相,促进细胞凋亡,致使细胞的耐药性改变。研究结果为胃癌的基因靶向治疗提供了新的依据,也为小分子药物的研究奠定了基础,对于胃癌的临床治疗具有重要的理论意义及潜在的应用价值。
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【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

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