NOX1对A549细胞增殖及凋亡的影响

发布时间：2018-10-13 12:24

【摘要】：背景肺癌是目前中国死亡率最高的癌症。抽烟、环境污染的加剧等均是加大患肺癌风险的危险因素。而活性氧(reactive oxygen species,ROS)在上述条件下表达量均上升。NADPH氧化酶NOX(non-phagocytic cell oxidase,NOX)是非吞噬细胞中产生ROS的主要来源,生理情况下其产生的活性氧作为第二信使传递细胞内的各种信号通路,但在外界各种因素如肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等的刺激下表达量升高,产生大量活性氧,对细胞和机体造成一系列的影响。目前有研究表明NOX1在许多肿瘤细胞系中表达量相对升高,这其中包括非小细胞肺癌。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)又称为应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase,SAPK),当受到外界的刺激后,JNK被磷酸化激活从而参与细胞凋亡信号通路。研究证实,NOX1产生的ROS能够调节JNK的活化水平。因此研究NOX1在肺腺癌A549细胞增值与凋亡中发挥的作用显得尤为重要。实验首先通过瞬时转染技术转染特异性的NOX1小干扰RNA(Small interference RNA,si RNA)抑制A549细胞中NOX1的表达,观察细胞ROS水平的改变及增殖活性和凋亡率的变化,再采用TNF-α刺激A549细胞,检测不同组别细胞凋亡率的改变,以及NOX1、p-JNK和相应的ROS的表达量的改变。通过上述实验来研究NOX1在A549细胞增殖与凋亡中发挥的作用,从而为NOX1在肺癌中的的作用提供理论依据。方法1实验方法1.1分别设置Mock组、NC组和NOX1si RNA组,观察抑制NOX1表达对A549细胞增殖和凋亡的影响。采用实时荧光定量PCR检测不同组别NOX1m RNA的表达量。为检测TNF-α刺激A549细胞后NOX1表达量的改变,设置空白对照组、TNF-α组和TNF-α+NOX1si RNA组。1.2细胞增殖活性检测:转染12 h后对Mock组、NC组和实验组进行MTT实验,自转染后12 h开始直至48 h之内,每隔12h分别检测不同组别在492nm处的光密度值。1.3细胞活性氧的测定:转染24h后对不同组别采用DCFH-DA标记后用流式细胞仪检测其荧光值。1.4细胞相应蛋白表达量的检测:转染NOX1si RNA至细胞48 h以后,提取不同组别细胞的蛋白进行Western blot实验,内参蛋白为β-actin,所得结果采用Quantity One软件分析不同组别蛋白相对表达量。1.5细胞凋亡率的检测:抑制NOX1表达的48 h后,消化不同组别的细胞并吹打混匀成单细胞悬液,Annexin-V-FITC、PI双染法处理细胞悬液,流式细胞仪上机检测不同组比细胞的凋亡率。2统计方法:采用SPSS 21.0对不同组别数据进行统计学分析,采用单因素方差分析比较三组的均数之间的差异,两两比较采用LSD法或Dunnett法。检验水准取α=0.05。结果1.转染NOX1si RNA对NOX1在A549细中表达的干扰效果:NOX1m RNA表达量与Mock组相比下降了约78%;NOX1蛋白的表达量与Mock组相比下降了约70%。2.抑制NOX1表达对A549细胞增殖活性的影响:与Mock组相比较,NOX1si RNA组细胞在24 h、36 h和48 h的增殖活性均下降(P0.05)。3.ROS表达量的改变:与Mock组相比,NOX1si RNA组的ROS水平下降,差异有统计学意义(P0.05)。与空白对照组相比较,TNF-α组的ROS水平升高;与TNF-α组相比,TNF-α组+NOX1si RNA组的ROS水平下降;与空白对照组相比,TNF-α组+si RNA组的ROS水平升高,差异均有统计学意义(P0.05)。4.Western blot:NOX1组的p-JNK表达量与Mock组和NC组差异无统计学意义(P0.05)。与空白对照组相比,TNF-α组的NOX1与p-JNK表达量均升高,差异有统计学意义(P0.05)。与TNF-α相比,TNF-α组+NOX1si RNA组的NOX1与p-JNK表达量均下降,差异有统计学意义(P0.05)。5.抑制NOX1表达对A549细胞凋亡率的影响:NOX1si RNA组细胞早期凋亡率与NC组和Mock组相比差异无统计学意义(P0.05)。而与TNF组相比,TNF-α组+NOX1si RNA组细胞凋亡率下降,差异有统计学意义(P0.05)。结论si RNA抑制NOX1表达能够抑制A549细胞的增殖活性;采用TNF-α刺激A549细胞后NOX1的表达量升高,在此基础上抑制NOX1的表达能够降低应激状态下A549细胞的凋亡,且该过程伴随着ROS和p-JNK表达量的改变。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2

【共引文献】