胰腺导管癌中miR-184的表达及与其临床生物学行为关系、机制的研究

发布时间：2018-10-14 20:26

【摘要】：背景胰腺癌是消化道常见恶性肿瘤,40岁以上年龄人群较为好发,男性比女性多见,其比例约为1.3:1,预后极差,死亡率在世界上排名第四。近年来,胰腺癌的发病率逐年上升,1988年,美国的发病率9.0/10万。瑞典的发病率较高,达到125/10万人,并在过去的20年保持不变。英国和挪威则有近一倍数量的增加。20世纪70年代与60年代相比,加拿大,丹麦和波兰发病率也有近五成的增加。在中国,胰腺癌已成为死亡率前十名的恶性肿瘤之一。上海,天津等高发区近20年增长了4倍,近年来,北京协和医院胰腺癌患者数量在医院历史上比上世纪50年代高出5?6倍。而据北京地区354例案例分析,近80%胰腺癌患者年龄在41至70岁,年轻胰腺癌患者比10年前有不断上升的趋势,且恶性程度更高,预后更差。目前提高胰腺癌患者存活率的唯一方法是进行手术切除,但85%的患者在治疗时已经属于晚期,只有约10%至15%的患者可以接受手术治疗,术后1年生存率仅为25%,手术后5年平均生存率不到5%,并且在过去30年里一直没有显著提高。除了手术,化疗也是目前治疗进展期胰腺癌、预防术后复发、延长病人生存时间和提高生活质量的重要手段之一。胰腺是一个既有外分泌功能又有内分泌功能的内脏器官。从体积上来说,执行外分泌功能的结构在胰腺中占的比例比较大,分泌出含有多种消化酶的胰液,胰液通过胰腺导管流入肠道,帮助消化食物。由于消化道是与外界相通的,所以称为外分泌,这部分如果发生炎症,将会使强大的消化酶进入腹腔,造成胰腺炎;这部分的细胞发生癌变,就是胰腺癌。胰腺导管癌占胰腺癌80%至90%,胰腺导管上皮细胞增生和其发生有着密切关系,在一些手术切除的标本中也发现了胰腺导管癌与胰腺导管上皮增生共同存在的现象。因而胰腺导管上皮增生可能是胰腺癌的癌前病变。有学者报道胰腺导管上皮增生的发病率为57%,胰腺癌的发生率为10%。胰腺癌进展快、转移早、预后差、误诊率比较高。由于早期诊断十分困难,因此一旦做出诊断85%都已经是中晚期的肿瘤。由于它的生物学特性表现,现在被公认为癌中之王,它是21世纪医学顽固的堡垒。因此,寻找更加敏感、特异的肿瘤标志物,使之与影像学方法相结合,成为有效筛查工具的需求十分迫切;加强胰腺癌发生、发展的分子生物学机制研究,为胰腺癌的早期诊断以及治疗提供有益的线索成为目前研究的热点。micro RNA(简称miRNA)是一类由基因组编码、细胞内源表达的、长度约为22nt的非编码小RNA。它通过降解靶基因m RNA或抑制其翻译过程,来调控真核细胞的基因表达。是广泛存在于真核生物中的一组短小的、不编码蛋白质的RNA家族,它们是由19-23个核苷酸组成的单链RNA;表达具有组织特异性和阶段特异性;与靶m RNA 3’-UTR结合,序列特异性的在转录后水平调控基因的翻译表达,在生物发育、脂肪代谢、细胞的分化、增殖和凋亡等过程中发挥着重要作用;miRNA具有高度保守性,即各种miRNA都能在其他种系中找到同源体。miRNA可作为肿瘤抑制剂或致癌物在起作用,特异的miRNA表达或高表达的miRNA可以用来探讨肿瘤的发生和发展过程。在正常组织和肿瘤组织中miRNA的表达变化,这些特征是miRNA可能成为一种生物标记物和治疗药物作用肿瘤诊断新的方向。因为大多数癌基因会导致癌症,因此可以设计一些人工miRNA阻碍其表达,从而抑制肿瘤的形成。目前,肿瘤与miRNA之间的关系进行了大量的研究,如胃癌、鼻咽癌、肝癌、舌鳞状细胞癌、肺癌、恶性淋巴瘤、乳腺癌等。miRNA的作用是多方面的,它改变细胞的命运形式是可以通过关闭一些关键基因实行,而且其靶基因产物相互作用形成一个环路,与其他通路形成网络调控关系,目前研究证实,人类30%的m RNA均通过某些机制处于miRNA调控下,随着研究的深入,其作用机制被更多地展现出来,将会给人类带来更多的福音。miR-184是一个位于小鼠9号染色体的印记基因,有着高度保守性。于2006年首次在哺乳动物细胞中被发现存在着表达,并且在小鼠的角膜上皮细胞中呈现高表达。研究结果显示,miR-184对干细胞的生长以及增殖有着关键的作用。随着研究的深入,在多种类型的肿瘤中也已发现了miR-184的表达发生改变,但其作用机制仍未完全明白。研究显示,在神经母细胞瘤中miR-184高表达时能够诱导肿瘤细胞的凋亡和生长周期停滞。采用实时定量PCR对舌鳞状细胞癌20例患者和156例健康对照者血浆中的miRNA进行检测,在舌鳞癌患者血浆中发现,miR-184有异常高表达,通过对血浆中miR-184表达进行抑制可以减少舌鳞癌细胞的增殖率,手术切除癌组织后血浆中miR-184水平相应降低。因此,血浆miR-184对舌鳞状细胞癌诊断及治疗疗效评估有一定价值。已有研究表明,PI3K家族蛋白参与细胞的增殖、分化和凋亡等生理过程的调控。PI3K有着一个庞大与功能复杂的大家庭,I型、II型、III型是其结构上的分型。其中I型PI3K又包含了两个亚型,IA和IB,他们从G蛋白偶联受体和酪氨酸激酶连接受体有着信号转导。PI3K中的IA型是由催化亚基是P110和调节亚基p85亚基组成的二聚体蛋白,具有双重活性的脂质和蛋白激酶。在正常细胞中,PI3K的活性受到多种机制的严格控制。一般来说,在静息状态下,无活性的p1lo-P85络合物被发现在细胞质中,等待合适的信号激活。PI3K激活的方式有两种:一是对生长因子受体或结合蛋白相互作用的酪氨酸残基磷酸化,导致两聚合物的构象变化和激活。RTK信号是从配体所介导的蛋白激酶所活化,导致细胞内的酪氨酸残基的磷酸化。酪氨酸残基磷酸化迅速成为细胞内信号蛋白的相应结合位点,结合到细胞膜p85-p110 SH2结构域并与P85形成复合体而被活化。另一种是通过RAS和P110的直接结合,从而激活PI3K信号通道。Akt也被称为蛋白激酶B(PKB),这是类似于蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC),是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,相对分子量为60000。可以直接磷酸化Akt相关的多种转录因子,通过这些转录因子的调节,可以抑制凋亡基因的表达,增强抗凋亡基因的表达,从而促进细胞的存活。此外,AKT还可以调节两种转录因子NF-κB和Bcl-2。NF-κB信号通路和许多细胞因子和生长因子在细胞分化、凋亡和存活有密切关系。在正常情况下,核因子-κB在细胞质中,它的抑制剂Ⅰ-κB与其结合在一起,转录活性被抑制。Akt-lkk在介导NF-κB降解和NF-κB激活是必需的,是NF-κB依赖的基因转录调节的关键过程,从而促进肿瘤细胞的存活起着重要的作用。除了凋亡和抗凋亡基因,Akt的促凋亡蛋白的直接磷酸化而促进细胞存活。此外,Akt可直接抑制半胱氨酸天冬氨酸-9活动。caspase-9的磷酸化可以促使Akt的活性丧失,从而中断下游信号。PI3K-Akt信号通路参与了肿瘤的发生发展过程,即通过抑制细胞凋亡,细胞缺氧和营养缺乏的耐受性增强,促进肿瘤的生长。目的miR-184是一种与肿瘤关系十分密切的分子,直接与肿瘤的发病进展有关,很可能是一种抑癌因素。但是miR-184在胰腺导管癌中表达情况目前仍未十分清楚,miR-184异常表达是否与胰腺导管癌细胞的侵袭、迁移、凋亡与细胞周期等生物学行为有关系,目前仍不得而知。因此,在本研究中,将胰腺导管癌中的miR-184表达水平作为研究对象,研究胰腺导管癌组织中miR-184表达水平,研究miR-184表达与胰腺导管癌的一系列病理临床数据的关联,探讨miR-184表达与患者生存期的相关性。同时对miR-184与胰腺导管癌的临床病理数据进行了研究,进一步研究miR-184对胰腺导管癌细胞的生物行为的影响。通过体外细胞系实验,研究探讨miR-184对胰腺导管癌细胞的生长、迁移、侵袭以及凋亡方面的作用,探讨miR-184调控的PI3K-AKT信号通路在胰腺导管癌进程中的作用。方法1 HE染色法确认实验纳入标准:临床诊断为胰腺导管癌,且未接受任何辅助治疗。胰腺导管癌根治性切术后胰腺癌组织标本和正常胰腺组织标本,经HE染色后组织形态学观察确认为胰腺导管癌。2 RT-PCR检测miR-184表达水平:检测组织中的miR-184表达水平。3 miR-184表达水平与患者临床病理参数及预后的关系:miR-184表达水平与胰腺导管癌患者临床病理参数之间的关系采用Mann Whitney U和Kruskal Wallis检验,miR-184表达水平与患者预后之间的关系采用Kaplan Meier进行检验。4细胞划痕实验检测细胞的迁移能力:胰腺导管癌细胞系CFPAC-1转染miR-184促进其表达,然后将细胞种植于培养板内,待细胞长满后,进行划痕实验,然后每天观察细胞生长迁移情况,以评估miR-184表达阳性的癌细胞迁移的情况。5 Transwell实验检测细胞的细胞侵袭能力:胰腺导管癌细胞系CFPAC-1转染miR-184促进表达后,将细胞置于Transwell小室上层,继续培养48小时后,显微镜下观察穿过小室的细胞数,分析细胞的侵袭能力。6流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期:胰腺导管癌细胞系CFPAC-1转染miR-184,同样阴性转染作为对照,转染48小时后,收集细胞,采用Annexin V和Propidium Iodide染色,染色后采用流式细胞仪进行分析,检测细胞凋亡与细胞周期情况。7探讨miR-184调控肿瘤细胞凋亡机制:western blot检测PI3K/AKT与JNK信号通路与miR-184的关系。结果1对胰腺导管癌组织及正常胰腺组织中miR-184表达水平进行检测,结果显示,在胰腺导管癌组织中miR-184表达水平下降,统计学分析表明癌组织内miR-184表达水平明显低于正常组织(P0.05)。2癌组织中miR-184表达水平低的胰腺导管癌患者预后更差,生存时间更短(P0.05),提示miR-184与患者预后呈正相关,miR-184可能在肿瘤侵袭转移方面发挥了功能。3细胞划痕实验结果表明,当CFPAC-1细胞过表达miR-184以后,细胞迁移速率较对照组癌细胞明显下降,P0.05。将过表达miR-184的CFPAC-1细胞种植到带有基质胶的Transwell小室,培养48小时后发现,过表达miR-184的CFPAC-1细胞穿过Transwell小室的能力低于对照组,二者之间比较具有明显的统计学差异。上述表明,miR-184潜在的具有抑制CFPAC-1细胞迁移和侵袭的能力,当细胞的miR-184过表达后,CFPAC-1细胞的迁移和侵袭能力明显下降。4在细胞过表达miR-184及用抑制剂抑制其表达后,相比于阴性转染的CFPAC-1细胞,miR-184过表达的细胞的凋亡率明显上升,抑制其表达后,凋亡率随之下降,二者相比较,具有统计学意义。5过表达miR-184的CFPAC-1细胞与对照组、inhibitor组相比G1期明显延长,S期明显缩短,细胞生长延滞。6通过对miR-184进行抑制,能够促使PI3K及AKT磷酸化水平增高、JNK1的活化,从而抑制细胞的凋亡。7在肿瘤的发生发展过程中,c-myc、E2F1及C-Jun基因的激活及调节异常导致细胞的不可控生长和异常分化,引起细胞的恶变。阻断c-myc、E2F1及C-Jun基因的表达对肿瘤细胞的影响已被广泛研究,本结果显示,通过对miR-184进行抑制,能够促使c-myc、E2F1及C-Jun基因的激活,从而促进肿瘤细胞增殖、抑制细胞的凋亡,引起细胞的恶变。8对凋亡相关蛋白进行检测,结果显示,通过对miR-184过表达,能够促使caspase-9、caspase-7及caspase-3表达水平升高,而Bcl-2表达水平降低,由此推断miR-184促进肿瘤细胞的凋亡的机制之一是对PI3K/AKT及JNK信号通路进行抑制而实现的。结论1胰腺导管癌中miR-184的表达水平较正常胰腺组织明显降低,提示miR-184与胰腺导管癌具有相关性。2胰腺导管癌组织内miR-184表达水平与病理组织学分级、淋巴结转移及远处转移灶有明显的相关性,因此推测miR-184与胰腺导管癌的恶性程度及侵袭转移密切相关;miR-184低表达的胰腺导管癌患者预后差,生存期更短,因此推测miR-184可能抑制了胰腺导管癌的恶性进展。3 miR-184低表达能够促进胰腺导管癌细胞生长、抑制其凋亡、促进癌细胞增殖侵袭转移,因此推测miR-184可能是胰腺导管癌的潜在的治疗靶点之一。4 miR-184促进胰腺导管癌细胞凋亡的机制之一是通过抑制PI3K/AKT及JNK信号通路活化实现的。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.9

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