TWIST上调SYT7在非小细胞肺癌中的作用及机制研究

发布时间：2018-10-17 08:13

【摘要】：第一部分TWIST下游与NSCLC侵袭转移相关的功能基因筛选目的:TWIST基因在多种肿瘤中存在高表达,通过转录调控下游靶基因的表达在肿瘤的发生、侵袭转移、血管生成、凋亡抵抗等进程中发挥重要的调节作用。本研究旨在通过全基因组表达谱芯片等高通量技术筛选TWIST下游与NSCLC侵袭转移相关的功能基因,探讨TWIST及其下游调控网络促进NSCLC浸润转移的新机制。方法:通过实时定量PCR检测四株常用肺癌细胞中TWIST的表达丰度,选取TWIST表达丰度最低的细胞株,通过划痕实验及Transwell迁移实验检测过表达TWIST后细胞转移能力的变化;通过全基因组表达谱芯片、PCR及基因功能高通量筛选方法获得TWIST下游与NSCLC侵袭转移相关的功能基因。结果:实时定量PCR结果显示,在常见的四种NSCLC细胞株(A549、H1299、H1975、H358)中,TWIST在A549及H1299细胞中高表达,在H358细胞中中度表达,在H1975细胞中低表达。划痕及迁移实验显示,TWIST的过表达显著增强了 H1975细胞的转移。全基因组表达谱芯片结果显示,TWIST过表达的H1975细胞中,根据|FC|大于1.3且P-value值小于0.05差异基因筛选条件,共获得差异表达基因1297个,其中上调589个,下调708个。通过生物信息分析及PCR验证,初步选择20个上调的基因(DUSP5、TNIP1、TMEM154、CCBE1、CYB5R2、MYEOV、NUAK2、RPS6KL1、PPIF、RIMS2、SYT7、ABHD5、CEP85、LST1、NFKBIE、HYI、POLR3G、SNHG12、UPP1、PXK)进行转移相关的高通量功能实验。结果显示,在分别敲除SYT7和CEP85后,过表达TWIST的H1975细胞迁移能力显著下降,敲除组与对照组的迁移距离之比分别为:0.12,0.35(p0.05),提示这两个基因为高通量筛选的与转移相关的基因。结论:1.TWIST过表达增强了肺癌H1975细胞的转移能力。2.SYT7、CEP85可能作为TWIST下游与NSCLC转移相关的功能基因,对TWIST及其下游基因功能的研究将有助于明确NSCLC浸润转移的新机制。第二部分SYT7在非小细胞肺癌中的作用及机制研究目的:细胞功能学及动物实验验证第一部分获得的可能的功能阳性基因SYT7,以明确其在NSCLC中的作用,并探讨相应的作用机制。方法:实时定量PCR检测SYT7在A549、H1299、H1975(TWIST过表达细胞株)及H125细胞中的表达丰度。shRNA干扰技术分别敲除H1975过表达稳定株(TWIST外源性高表达)、H1299(TWIST内源性高表达)及A549细胞(TWIST内源性高表达)中的SYT7基因,Transwell侵袭、迁移实验及尾静脉裸鼠成瘤实验检测SYT7敲除对肺癌细胞侵袭转移能力的影响。MTT增殖实验和FACS细胞凋亡实验检测SYT7敲除后A549细胞增殖及凋亡的变化,Western-blot检测SYT7敲除后EMT相关标志物的变化。使用TCGA数据检测SYT7在肺癌组织与正常肺组织中的表达、甲基化水平及与临床预后的关系。通过全基因组芯片实验筛选SYT7敲除后的下游差异基因,Western-blot验证部分差异基因的表达并初步探索SYT7发挥调控作用的可能机制。结果:实时定量PCR结果显示,SYT7基因在TWIST过表达的H1975细胞中表达丰度为高表达,在其余三株肺癌细胞中表达丰度为中度表达。Transwell侵袭、迁移实验及裸鼠成瘤实验显示,SYT7的敲除显著抑制了肺癌H1975(TWIST过表达稳定株)、A549及H1299细胞的侵袭转移能力(p0.05)。SYT7敲除后显著抑制了 A549细胞的增殖,促进细胞的凋亡,同时上调上皮标志物E-cad的表达,下调间叶细胞标志物N-cad、Vimentin的表达。TCGA数据检测结果显示,SYT7在肺癌组织中高表达,并与肺鳞癌患者的预后相关。与正常肺组织相比,肺腺癌中SYT7基因CpG岛的甲基化水平更低(p0.05)。SYT7敲除后共获得差异基因746个(|FC|2,P0.05),其中上调376个,下调370个,Western-blot验证DDX58、HMGB1、JUN、STAT1的蛋白表达差异与芯片结果一致。蛋白质相互作用网络分析显示SYNCRIP等hnRNPs与EIF4G1、EIF4E等EIFs有着广泛而密切的关系。结论:1.SYT7的敲除抑制肺癌细胞的增殖、侵袭转移及EMT,并促进细胞的凋亡,SYT7可被视为非小细胞肺癌新的致癌基因。2.SYT7在肺癌组织中高表达,并与肺鳞癌患者的预后相关,DNA甲基化修饰可能为SYT7在肺腺癌中高表达的调控机制之一。3.SYT7可能通过与SYNCRIP或其复合物的相互作用上调EIF4G1、EIF4E等EIFs的表达,从而在非小细胞肺癌的发生发展中发挥重要的调控作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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本文编号：2276056