高效靶向CCK2R重组毒素的筛

发布时间：2018-10-17 09:10

【摘要】：胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤，也是人类主要的癌症死亡原因之一。在我国，胃癌的死亡率仅次于肺癌和肝癌。据统计，全球每年新增胃癌病例高达数百万，其中我国占42％左右；全球每年因为胃癌死亡的人数约为80万，中国占35%。常规的胃癌治疗手段包括手术、化疗、放疗、生物免疫治疗等。手术治疗仍是根治胃癌的最好选择，但并不是所有的胃癌患者都可以进行手术，而且术后容易复发和转移，预后较差；化疗和放疗对胃癌的辅助治疗具有重要意义，但其副作用太大，很容易破坏患者的免疫系统；生物免疫治疗如肿瘤疫苗，多数还处于研发或临床试验阶段，治疗效果还未可知。近年来，分子靶向治疗成为肿瘤治疗领域的一个新热点，它符合胃癌异质性明显、生物学行为复杂等特点。分子靶向治疗通过特异性靶向或调节肿瘤细胞上异常表达的标志性分子，阻断信号转导通路，从而抑制肿瘤细胞的生长、侵袭或转移，和放化疗等传统治疗手段相比具有特异性强、选择性高等优点。本实验的主要目的是构建并筛选一种靶向胆囊收缩素II型受体（CCK2R）的重组毒素，通过细胞毒性试验及动物试验获得该重组毒素的杀细胞活性、抗肿瘤活性、毒理及安全性等成药性评价，确定其临床应用价值，并初步建立该重组毒素临床适用病例的分析方法，为临床试验奠定基础，同时为设计胃癌的个性化治疗方案提供指导。本实验室前期根据CCK2R在正常细胞与肿瘤细胞上表达量和亲和力的巨大差异，以酰胺化的胃泌素17（G17）为导向与截短并经修饰的绿脓杆菌外毒素（PE38）重组构建了一种能靶向胃癌的免疫毒素rG17PE38。为了筛选出分子量更小，活性更好的重组毒素，我们利用基因工程手段分别以正向及反向的N端截短的G1（7G13、G14、rG13、rG14）及N端延长的八肽胆囊收缩素CCK（8CCK9、CCK12、rCCK9、rCCK12）为导向与PE38融合构建了8种重组毒素。这8种重组毒素在大肠杆菌中均以可溶性形式表达，但是细胞毒性实验表明只有以反向的rG13、rG14、rCCK9和rCCK12为导向构建的4种重组毒素对几种胃癌细胞系和结肠癌细胞系具有杀伤活性，而且它们和rG17PE38相比，无论在表达量还是杀细胞活性上都没有表现出优势，因此我们最终确定用rG17PE38进行后续实验。采用粗略纯化与精细纯化相结合的方式，对rG17PE38进行了纯化。首先用饱和硫酸铵沉淀法去除大部分杂质，然后依次采用疏水层析、离子交换层析进行精细纯化，最后用凝胶过滤层析脱盐。对饱和硫酸铵沉淀的条件（硫酸铵饱和度、pH值、沉淀时间等），层析条件（层析介质、缓冲液pH、盐浓度等）进行了优化。从纯化结果看，经40%饱和硫酸铵沉淀后，rG17PE38的纯度大约可达50%左右；经过疏水层析和离子交换层析后，纯度可达92%左右；最后经过脱盐处理后，终纯度达95%左右，满足后续实验要求。为了便于保存，我们对纯化后的rG17PE38进行冻干，并优化了冻干条件；然后采用CCK-8毒性检测试剂盒对冻干后的目的蛋白进行活性和稳定性分析；用间接免疫荧光方法对rG17PE38在靶细胞上的定位、内化情况进行了检测；细胞毒性实验分析了rG17PE38与受体竞争结合情况；最后通过流式细胞分析仪检测rG17PE38是否可以诱导细胞凋亡。实验结果表明冻干后的rG17PE38活性几乎没有下降，而且在4℃至少可以放置10天左右，稳定性良好；rG17PE38通过识别靶细胞上的CCK2R后快速定位到靶细胞表面，然后内化进入细胞发挥毒性作用；而rG17PE38发挥毒性作用的机制之一就是诱导细胞凋亡。为了进一步分析rG17PE38的抗肿瘤活性，采用皮下接种胃癌悬液细胞的方式建立胃癌裸鼠模型，并用rG17PE38对荷瘤裸鼠进行治疗，观察rG17PE38的抑瘤效果、对裸鼠生存期的影响、毒副作用以及获得安全性评价等。皮下接种胃癌BGC-823细胞后15天左右成功建立了胃癌裸鼠模型，治疗分高、中、低3个剂量组，其中高剂量组和中剂量组裸鼠的肿瘤生长缓慢、无转移而且生存期明显延长，组织切片病理结果显示rG17PE38对裸鼠无明显的毒副作用。综合以上实验结果可以预测rG17PE38是一种很有潜力的胃癌靶向治疗药物。最后，，为了限定rG17PE38靶向的临床病例范围，以便以后能准确地对胃癌患者进行治疗，我们初步建立了一种CCK2R的检测方法。分别利用RT-PCR、western-blotting及荧光定量PCR方法对各种细胞及胃癌组织样本中的CCK2R进行定性和定量检测，分析样本中CCK2R的含量与rG17PE38有效性之间的关系，预测rG17PE38可能适用的临床病例。检测的20种细胞和20例临床胃癌手术样本中，其中有5种癌细胞和5例胃癌样本检测到CCK2R的表达，而且PCR与western-blotting方法的检测结果一致。根据细胞毒性实验、动物试验及胃癌患者的临床病理诊断结果，我们初步预测14号、1号和20号患者可能是rG17PE38适用的病例。总之，通过以上实验我们分别从细胞及动物水平证实了rG17PE38具有特异性靶向抵抗胃癌的能力，希望本实验的实验结果能为今后的临床试验及胃癌个性化治疗方案的设计提供一定的参考。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2

【参考文献】