【摘要】：第一部分流式细胞术检测循环微泡方法及外周血标本处理参数研究 目的：探讨离心速度、离心时问、储存条件及抗凝剂对血浆来源微泡(microvesicles, MVs)数量及大小分布的影响。 方法：离心获取肝素及EDTA抗凝血无血小板血浆(platelet free plasma, PFP)及MVs, calcein-AM标记MVs后,应用流式细胞仪检测、分析MVs数量及大小分布,研究不同离心条件(速度：16000×g和20500×g；时间：15、30和60分钟)、储存条件(PFP于-80℃储存一周或四周：MVs于4℃储存3-4天或一周：MVs于-80℃储存一周或四周)及抗凝剂(肝素或EDTA)对循环MVs数量及大小分布的影响。 结果：经calcein-AM标记后,流式细胞术检测发现EDTA抗凝血浆来源MVs与肝素抗凝血浆来源MVs均为小于1μm粒子,MVs大小主要分布于0.2-0.5μm之间,其次为0.5-0.8μm区间,而在0.8-1.0μm区间分布数量最少;MVs数量不受抗凝剂影响,但抗凝剂影响MVs大小分布；不同离心速度及时间对MVs数量及大小分布无明显影响；肝素抗凝血浆来源MVs或PFP储存不同时间显著改变MVs数量及大小分布；EDTA抗凝血浆来源MVs数量及大小仅在MVs储存于-80℃高达四周后受到影响。 结论：Calcein-AM能够有效地从血浆中鉴定出MVs,可作为annexin-V的替代物用于标记MVs行流式检测。与肝素相比,EDTA能够更好地保存MVs数量及大小。PFP于16000×g离心15分钟足以满足提取MVs的需要,这有利于标本的批量处理。与MVs这一储存状态相比,PFP状态是更好的储存方法。该研究提供了MVs收集、储存及分离提取的方法学,为今后MVs作为疾病生物标记物的研究提供了很好的指导。 第二部分多发性骨髓瘤患者循环微泡与疾病相关性研究 目的：研究多发性骨髓瘤患者循环骨髓瘤细胞来源MVs(multiple myeloma-derived MVs, MM-MVs)及骨髓瘤干细胞来源MVs数量与疾病临床特征及其主要生化指标的相关性,为今后MM-MVs作为多发性骨髓瘤(multiple myeloma. MM)新型生物标记物的确立提供实验依据；初步探讨骨髓瘤患者骨髓及尿液标本中MVs的流式检测。 方法：采用第一部分研究中确立的方法收集正常对照及MM患者外周血标本,同时收集MM患者尿液及骨髓标本,差异离心法获取MVs, calcein-AM标记后,流式细胞术分析MVs数量及其表面不同CD分子(CD138, CD38, CD45, CD19)表达特点,统计分析正常对照与MM患者循环MVs数量及表面抗原表达差异,分析评估MM-MVs与MM临床特征的相关性。 结果：CD138单个表面标记可以鉴别正常对照及MM患者循环骨髓瘤细胞来源MVs,我们将calcein-AM+、CD138+、直径小于1μm的粒子定义为MM-MVs, MM患者循环MM-MVs数量明显高于正常对照,该结果表明MM-MVs具有诊断价值；MM患者循环MM-MVs数量与骨损害、肾损害呈明显正相关关系,与临床常用的提示肿瘤负荷及预后指标乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)、β2微球蛋白(β2-croglobulin, β2-MG)值正相关;MM-MVs数量与临床疾病分期、分型暂无相关性。CD38是除CD138外MM另一常用检测指标,MM患者外周血循环CD138+CD38+MVs数量及其在总MVs中所占比例均明显高于正常对照；MM患者循环CD138+CD38+MVs数量与β2-MG及LDH值有正相关关系,提示可用于检测肿瘤预后。CD138-CD19+或CD38+CD45-是目前公认的MM干细胞表面标记,我们认为表面具有这些标记的MVs为MM干细胞来源。MM干细胞来源MVs数量(CD138-CD19+和CD38+CD45-MV数量之和)及其在总MVs中的比例明显高于正常对照；MM患者干细胞来源MVs数量与β2-MG相关(r=0.461, p=0.047).患者骨髓及尿液标本中也可检出具有上述表面标记的MVs。 结论：应用流式细胞术,通过对MVs表面抗原的检测,我们可在MM患者外周血中检测到MM特异性MVs。这些循环MVs与MM常见临床并发症及预后指标明显相关,有望成为新型MM生物标记物用于临床辅助诊断及预后判断,并为今后从MM-MVs这一全新视角研究MM发病机制提供了有力的临床依据。本研究首次检出MM干细胞来源MVs,有力拓展了临床MVs的研究宽度。骨髓及尿液标本中同样可检测到MM特异性MVs,且尿液具有标本获取简单无创的优点,有助于进一步推进MVs在MM中的应用。 第三部分多发性骨髓瘤细胞微泡对肾小管上皮细胞作用及机制初探 目的：研究人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226、U266细胞来源微泡(MM-MVs)对人肾小管上皮细胞HK-2的作用并初步探讨其机制,以人慢性髓细胞白血病细胞株K-562细胞来源MVs作为疾病对照。 方法：RPMI8226. U266及K-562细胞经无血清培养基培养24h后差异离心法获取MVs,随后作用于HK-2细胞。CCK-8法检测不同浓度(1、5、10、50μg/ml)MVs处理不同时间(24、48、72h)后HK-2细胞的生长增殖情况；Annexin V-PI凋亡试剂盒检测不同浓度MVs作用不同时间(24、48、72h)后HK-2细胞的凋亡及坏死情况；Western blotting检测10μg/ml MVs作用48及72h后HK-2细胞内caspase-3(凋亡指标)、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin (上皮间质转化指标)、p-MLKL (坏死性凋亡指标)及LC3(自噬指标)蛋白表达水平变化。 结果：CCK-8检测发现不同浓度MM-MVs作用48h后能够明显抑制HK-2细胞的生长,而作用72h后MM-MVs对HK-2细胞的生长抑制作用明显减弱；不同浓度K-562细胞来源MVs作用HK-2细胞不同时间对HK-2细胞生长无明显影响。AnnexinV-PI标记HK-2细胞,流式细胞术检测后发现不同浓度RPMI8226、U266细胞来源MVs作用HK-2细胞48h后细胞有明显凋亡或坏死发生,且随着MV浓度的增加凋亡率明显升高,而作用72h后HK-2细胞呈现明显凋亡抑制;K-562细胞来源MVs对HK-2细胞的凋亡或坏死无明显影响。Western blotting检测发现10μ/ml MVs处理48h后,HK-2细胞内caspase-3、 pMLKL、E-cadherin、N-cadherin及LC3蛋白表达增加,提示细胞发生凋亡、坏死性凋亡及自噬,而vimentin蛋白表达下降；K562-MVs作用48h后,上述蛋白变化不明显。不同细胞来源MVs作用HK-2细胞72h后,细胞内各蛋白变化趋势与48h时基本相同。值得注意的是,与48h相比,MM-MVs处理HK-2细胞72h后,细胞内caspase-3表达水平下降,提示72h时MM-MVs促HK-2细胞凋亡能力下降。 结论：MM-MVs作用于HK-2细胞48h后抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、诱导细胞发生凋亡性坏死及自噬,作用72h后HK-2细胞凋亡受抑；而K-562细胞来源MVs对HK-2细胞生长增殖及凋亡无明显影响。这些结果提示,MM-MVs对HK-2细胞的作用具有疾病特异性,可能是MM肾损害的全新机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.3
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本文编号：2284862
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