GDNF经NRP1-β-catenin-CXCL1信号通路促恶性胶质瘤细胞增殖

发布时间：2018-10-21 20:15

【摘要】：恶性胶质瘤是中枢神经系统中最为常见的原发性肿瘤,生长迅速,恶性程度高,病人预后差。研究发现,胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)在恶性胶质瘤中显著高表达,且可以促进胶质瘤细胞的增殖。GDNF是转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族的一员,能够通过与膜受体的结合,激活相应细胞内信号转导通路,进而促进胶质瘤细胞的增殖,但具体机制尚不清楚。目前已知GDNF的膜受体具有多样性,在不同细胞中可能有不同的膜受体,进而启动的细胞内信号转导通路和最终的生物学效应也不尽相同。本实验以大鼠胶质母细胞瘤细胞系C6细胞作为研究对象,探索外源性给予GDNF引起C6细胞增殖的过程中可能发挥关键作用的膜受体、细胞内信号通路以及增殖相关的靶基因等,希望借此找到能够抑制胶质瘤细胞增殖的可能的潜在性生物靶点,从而改善胶质瘤病人的预后。目的探索在外源性给予GDNF促C6大鼠胶质瘤细胞增殖的过程中,GDNF的可能膜受体、相关的细胞内信号通路以及和增殖相关的靶基因。方法C6细胞克隆自N-亚硝基甲脲诱导的大鼠源胶质母细胞瘤细胞,再通过后续的体外培养和动物传代交替后形成,其应用非常广泛。本研究使用的C6胶质瘤细胞购于中国科学院细胞/干细胞库。1.常规培养C6细胞和正常原代星形胶质细胞,均选用处于对数生长期的细胞进行后续检测;流式细胞术确定C6胶质瘤细胞G0/G1期同步化效果最佳的血清饥饿条件;CCK8实验确定外源性给予GDNF促C6胶质瘤细胞增殖的最佳作用浓度和时间点,并使用流式细胞术和Ed U染色方法对所得结果进行验证;2.收集C6细胞和原代星形胶质细胞,提取细胞膜蛋白;分别以GST和GST-GDNF融合蛋白作为诱饵,对膜蛋白进行GST沉淀(pull-down)实验,并进一步利用液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术和基因本体学(gene ontology,GO)分析方法,筛选出可能和GDNF结合的蛋白;3.以筛选出的神经纤毛蛋白1(neuropilin-1,NRP1)作为进一步研究对象。应用细胞免疫荧光染色方法观察NRP1在C6细胞中的蛋白质表达情况;应用Oncomine?平台分析脑胶质瘤和正常大脑芯片数据的NRP1m RNA表达水平;并使用激光共聚焦技术检测外源性给予GDNF对于NRP1在C6胶质瘤细胞中分布的影响;4.利用ZDOCK服务器进行GDNF和NRP1之间的蛋白质对接,提取二者间最佳对接模式;进一步使用Py MOL软件分析二者间相互作用的氢键和静电相互作用;使用免疫共沉淀技术判断NRP1和GDNF间是否能够结合;逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)和Western Blot(WB)实验深入探讨外源加入GDNF对NRP1的基因和蛋白水平的影响;5.构建靶向大鼠NRP1基因的RNA干扰慢病毒载体,并感染C6细胞;分别在使用anti-NRP1抗体和NRP1干扰慢病毒处理的情况下,利用CCK8实验检测外源性给予GDNF的促C6细胞增殖作用;6.分别利用WB和PCR技术测试外源性GDNF对NRP1的蛋白质表达和m RNA表达的影响;从c Bioportal下载胶质母细胞瘤的相关数据,利用两样本秩和检验、Cox回归模型和Kaplan-Meier生存曲线分析NRP1过表达情况对患者生存和预后的影响;7.血清饥饿致C6细胞细胞周期同步化后,外源性加入GDNF,提取胞浆、胞核蛋白,WB实验和免疫荧光染色观察β-catenin在胞浆、胞核中分布的变化;8.对上述提取的胞浆胞核蛋白用β-catenin抗体进行免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP),再将富集所得的蛋白进行质谱分析,得到外源性给予/不给予GDNF情况下能够和β-catenin结合的差异表达蛋白,继而利用DAVID软件进行GO分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,以及利用STRING和Cytoscape软件进行蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interactions,PPIs)网络分析(分析目标:差异表达蛋白以及GDNF、NRP1和CTNNB1);9.以分析筛选得到的Ras相关的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)作为研究对象,进行其和β-catenin之间的免疫共沉淀实验。10.血清饥饿致C6细胞细胞周期同步化后,外源性加入GDNF 0、0.5、1和24 h时,提取总RNA;进行m RNA转录组测序,检测外源性给予GDNF 0.5、1和24 h相较0 h时的差异表达基因,生物信息学筛选GDNF促增殖相关性基因,通过RT-PCR实验进行验证;11.以分析得到的CXC趋化因子配体1(chemokine(C-X-C motif)ligand 1,CXCL1)作为研究对象,荧光素酶报告基因实验检测外源性GDNF是否增强了CXCL1启动子活性;生物信息学方法探寻能够启动CXCL1转录的β-catenin的共转录因子。结果1.外源性GDNF能够促进C6大鼠胶质瘤细胞的增殖,最佳的作用浓度和时间点为40 ng/ml,48 h;2.膜蛋白提取并以Na/K ATP酶作为内参验证无误;GST沉淀联合质谱实验(全程相应质量控制)辅以GO本体学分析筛选能和GDNF结合的膜蛋白,结果显示:和大鼠原代星形胶质细胞相比,C6胶质瘤细胞上特异的能够和GDNF结合的膜蛋白有吸引素(Attractin,ATRN),NRP1和神经纤毛蛋白2(neuropilin-2,NRP2)。3.利用Oncomine?平台分析来自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据集的脑GBM与正常脑组织的m RNA表达数据,结果显示NRP1、NRP2和整合素β-1(Integrin beta-1,ITGB1)表达显著增加,而胶质细胞系源性神经营养因子受体α1(GDNF family receptor alpha 1,GFRA1)、受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RET)、神经细胞粘附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)、钙粘着蛋白-2(Cadherin-2,CDH2)、多配体蛋白聚糖(Syndecan-3,SDC3)和ATRN没有显着差异;以筛选出的NRP1为进一步研究对象;免疫荧光染色结果表明,与正常星形胶质细胞相比,C6细胞中NRP1表达显著增加;激光共聚焦技术显示外源性给予GDNF可将更多的NRP1募集到C6胶质瘤细胞膜上;4.利用ZDOCK服务器进行GDNF和NRP1之间的蛋白质对接,并用Py MOL软件分析,结果显示二者可以通过氢键和静电稳定相互作用;其中,GDNF的201号残基与NRP1的残基形成4个氢键;免疫共沉淀技术也证明NRP1和GDNF间能够结合;5.构建NRP1干扰慢病毒载体并感染C6细胞,并予以验证;在NRP1敲减或使用NRP1中和抗体的情况下,CCK8实验结果显示外源性GDNF促C6细胞增殖的作用减弱;6.WB和PCR实验显示外源性GDNF诱导了C6细胞中NRP1的蛋白质和m RNA表达水平增加;利用两样本秩和检验、Cox回归模型和Kaplan-Meier生存曲线分析从c Bioportal下载的胶质母细胞瘤相关数据,结果显示,NRP1 m RNA高水平组比其他患者的总生存期(overall survival,OS)和无病生存期(disease-free survival,DFS)都显著降低;7.提取的胞浆、胞核蛋白分别以胞浆和胞核的参照物进行WB实验,验证无误;WB实验和免疫荧光实验显示外源性GDNF作用后,β-catenin向细胞核内转移明显,核内蛋白质水平升高;8.IP联合质谱实验结果显示在GDNF作用下,核内的Rac1等与β-catenin的结合量增多;生物信息学分析结果显示上调的差异表达蛋白的GO和KEGG主要富集于线粒体相关条目;而利用STRING和Cytoscape软件构建PPI网络的结果显示Rac1可能在从NRP1到β-catenin的细胞内信号传递通路中发挥作用;9.免疫荧光共沉淀结果显示:C6细胞中Rac1可以和β-catenin结合;10.外源性GDNF处理C6胶质瘤细胞后提取总RNA,质检无误;m RNA测序结果显示外源性给予GDNF后不同时间段都有增殖相关性的CXC趋化因子配体1(C-X-C motif chemokine ligand 1,CXCL1)的基因CXCL1表达水平升高,RT-PCR实验验证了这一结果;11.荧光素酶报告基因试验结果显示外源性GDNF增强了CXCL1启动子活性;生物信息学方法预测核转录因子κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NFκB)能作为β-catenin的共转录因子启动CXCL1转录。结论GDNF促胶质瘤细胞的增殖作用需要一个特定的跨膜受体来诱发胞内信号。我们的研究结果表明跨膜蛋白NRP-1能够和GDNF结合启动胞内信号,介导GDNF的促胶质瘤细胞增殖作用,在此过程中,NRP1是GDNF的可能膜受体。当GDNF-NRP1形成后,胞浆内的Rac1-β-catenin被激活并发生核转移,进而促进与增殖相关基因CXCL1的表达增加。至此,我们提出了GDNF促进胶质瘤细胞增殖的一条可能的信号通路:GDNFNRP-1-β-catenin-CXCL1,关于这一通路的深入研究有望为胶质瘤的治疗提供潜在的药物作用靶点。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.41
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本文编号：2286243