CXCR4通过调控CYP1B1参与非小细胞肺癌顺铂耐药的研究

发布时间：2018-10-22 19:46

【摘要】：背景肺癌(Lung cancer)在我国及世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均居恶性肿瘤之首。据2014年世界卫生组织所发报告显示,每年约180万新发病例；五年生存率仅为15%,2012年全球肺癌死亡病例约160万例,并且男性和女性肺癌死亡的病人分别约占全球癌症死亡总人数的24%和14%。在我国,每年肺癌新发病例为67.6万,死亡病例56.5万。非小细胞肺癌在肺癌中占较大多数,但许多非小细胞肺癌患者在诊断时已属晚期,丧失了手术机会,多模式的化疗成为非小细胞肺癌晚期重要的治疗手段。以顺铂为基础的联合治疗已成为非小细胞肺癌的一线化疗方案,然而顺铂的耐药性问题越来越突出,制约了抗肿瘤药物疗效的发挥,导致化疗的失败。探索非小细胞肺癌顺铂耐药的发生机制,是近年来研究的热点。CXCR4是G蛋白耦联的七次跨膜受体,具有高度的保守性。其编码基因位于染色体2q21,共有352个氨基酸组成。其胞外N端区与配体结合,胞内区则与G蛋白偶联,C端含丝氨酸/苏氨酸可磷酸化。通过参与信号转导在胚胎发育、炎症及免疫反应、血管生成、造血调控等方面发挥重要作用。自2001年Muller首先报道CXCR4在乳腺癌组织中高表达以来,研究发现CXCR4在胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌,前列腺癌和卵巢癌等多种肿瘤细胞普遍表达,在增长、迁移、侵袭过程中具有重要作用,通过与相对应的特异性配体(CXCL12)结合,产生靶器官的特异性转移。我们前期研究发现趋化因子受体4(CXCR4)在肺癌组织中高表达,并参与了肺癌的增殖和侵袭,导致肿瘤的转移。也有研究发现CXCR4的表达与部分肿瘤的耐药相关。Hope等报道急性髓细胞性白血病通过高表达CXCR4进而促进G0期的急性髓细胞性白血病细胞亚群集聚在基质层。而处于G0期的急性髓细胞性白血病细胞对化疗药物不敏感,进而产生耐药。Li J等通过采用免疫组化方法发现CXCR4在上皮性卵巢癌的表达与顺铂耐药呈正相关,而通过RNA干扰技术降低上皮性卵巢癌细胞中CXCR4表达可逆转顺铂耐药的发生。但CXCR4是否参与肺癌顺铂耐药的产生及相应机制有待深入的研究。第一部分CXCR4表达与肺癌顺铂耐药相关性的研究目的比较CXCR4在肺癌顺铂耐药组和敏感组的表达差异；比较CXCR4在肺癌A549顺铂耐药细胞株(A549/DDP)及其亲本细胞(A549)表达的差异。方法收集武汉大学人民医院胸外科于2012年5月至2015年10月行手术切除的64例非小细胞肺癌患者的病理标本及临床资料,并进行随访。如无病生存时间小于12个月(包括12个月)被认为对铂类耐药,无病生存时间超过12个月者被认为是对铂类敏感。运用免疫组织化学法分析CXCR4在64例非小细胞肺癌组织中表达：采用RT-PCR、Western-blot和免疫荧光实验分析CXCR4在肺癌A549顺铂耐药细胞株(A549/DDP)及其亲本细胞(A549)表达。结果本组获得随访的共有64例患者,共有32例患者被认定为顺铂耐药,即耐药组32例,敏感组32例。在检测的32例顺铂敏感的肺癌组织标本中,CXCR4的阴性表达率为40.6%,低表达28.1%,中等表达18.8%,高表达12.5%;而检测的32例顺铂耐药的肺癌组织中,CXCR4的阴性表达15.6%,低表达34.4%,中等表达21.9%,高表达28.1%,两者之间的差异具有统计学意义(P0.05);耐药组的染色评分1.63±1.07(而敏感组1.03±1.06),两者之间的差异具有统计学意义(P.001)。RT-PCR、Western-blot和免疫荧光实验分析等实验证实CXCR4在肺癌A549顺铂耐药细胞株(A549/DDP)表达明显高于其亲本细胞(A549)的表达,差异具有统计学意义(P0.001)。结论CXCR4在顺铂耐药的肺癌组织及细胞中高表达,可能具有潜在的促进肺癌顺铂耐药作用。第二部分CXCR4对非小细胞肺癌耐药性影响的研究目的拟通过RNA干扰技术观察降低CXCR4的表达对肺癌细胞顺铂耐药的影响,进一步探讨CXCR4在肺癌顺铂耐药中的作用。方法通过构建靶向CXCR4的RNA干扰质粒,并通过脂质体系统将重组质粒转染进入人肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP及其亲本细胞株A549；应用RT-PCR和Western blot分别检测CXCR4 mRNA和蛋白表达水平；利用流式细胞仪进行细胞凋亡检测；Western blot检测顺铂作用对人肺癌A549细胞和A549-DDP细胞CXCR4蛋白的影响；CCK-8法检测细胞增殖；MTT法检测RNA干扰技术沉默CXCR4表达对顺铂耐药性的影响。结果成功构建CXCR4干扰质粒;siRNA沉默CXCR4的表达后,CXCR4在mRNA和蛋白表达水平受到明显抑制。CCK-8法结果显示si-CXCR4 A549和si-CXCR4 A549/DDP组细胞的受到抑制,并在培养的第48h和72h其增殖能力显著低于si-NC A549和si-NC A549/DDP组；流式细胞术检测CXCR4基因表达抑制后对A549、A549/DDP细胞凋亡的影响,与空载体对照组(11.16%和4.93%)相比,si-CXCR4 A549和si-CXCR4 A549/DDP结果显示两组组细胞的凋亡率分别为20.62%和6.64%%；MTT法检测结果显示抑制CXCR4基因表达后,与对照组A549/DDP相比,顺铂对si-CXCR4 A549/DDP细胞半数抑制浓度(IC50)明显下降(14.837±0.099 μ g/m1和9.969±0.318μ g/m1),差异具有统计学意义。结论：通过RNA干扰技术沉默CXCR4的表达可降低肺癌细胞顺铂耐药的现象,进一步证实CXCR4参与了肺癌的顺铂耐药。第三部分CXCR4通过CYP1B1调控肺癌细胞的耐药性目的我们在前期的研究中发现肺癌顺铂耐药与肺癌细胞的CXCR4的表达呈正相关,而沉默CXCR4的表达可以降低A549顺铂耐药细胞株的耐药性,提示CXCR4与肺癌顺铂耐药有着密切的关系。但CXCR4介导肺癌顺铂耐药的作用机制不明晰。方法本研究通过生物信息学筛选分析数据集GSE42568中293例和数据集GSE41271中275例肺癌组织的基因组表达数据,寻找能与CXCR4相互作用的蛋白介导顺铂耐药；并通过免疫组化检测二者在病理标本表达情况;western-blot检测分析siRNA CXCR4转染前后的肺癌A549/DDP细胞株的CYP1B1蛋白的表达情况。siRNA干扰CYP1B1的表达,并通过RT-PCR和Western blot分别检测CYP1B1在mRNA和蛋白表达水平；MTT法检测RNA干扰技术沉默CYP1B1表达对顺铂耐药性的影响；流式细胞仪进行细胞凋亡检测。结果通过生物信息学方法得出CXCR4和CYP1B1参与肺癌耐药；免疫组化检测发现CYP1B1在顺铂耐药组肺癌组织中表达明显高于顺铂敏感肺癌组织；采用Pearson相关分析方法分析CXCR4与CYP1B1在顺铂耐药及敏感两组肺癌组织中的表达呈正相关；western-blot检测分析siRNA转染前后的肺癌A549/DDP细胞株的CYP1B1蛋白的表达情况。结果显示与转染空白载体的细胞相比,发现肺癌A549/DDP细胞株经si-CYP1B1转染后CYP1B1蛋白表达水平均明显降低。RNA干扰CXCR4表达后,Western blot结果显示CYP1B1在si-CXCR4 A549/DDP组细胞的表达受到抑制,显著低于si-NC A549/DDP组。siRNA下调CYP1B1的表达后,CCK-8实验结果提示与si-RNA NC对照组细胞相比,在顺铂作用下si-CYP1B1组细胞活性明显降低；与空载体对照组(2.0%和0.7%)相比,流式细胞术检测结果提示si-CYP1B1 A549和si-CYP1B1 A549/DDP两组组细胞的凋亡率分别为7.5%和2.0%,凋亡有明显增加。结论：CXCR4通过调控CYP1B1的表达参与肺癌顺铂耐药的形成过程。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

【参考文献】