【摘要】：研究背景与目的肿瘤转移是肿瘤致死的重要原因,同时也是一个非常复杂的生化反应过程。这个过程是通过多个连续的步骤实现的,包括肿瘤细胞原位增殖、突破基质和血管壁、进入血液循环、粘附并穿出血管、定殖到靶器官等,其中肿瘤细胞粘附并穿出血管是整个转移过程的关键步骤,决定了转移的肿瘤细胞最终到达的目的地。大量的临床观察以及研究已经证明,肿瘤具有向某些特定器官转移的倾向,如结肠癌易转移至肝脏,乳腺癌易转移至肺和肝脏,前列腺癌易转移至骨,这种行为被称为肿瘤的器官特异性转移。人们很早就认识到肿瘤这种特殊的的行为,并试图探究其背后的机制。1889年,斯蒂芬·派杰特(Stephen Paget)提出“种子和土壤”假说,认为肿瘤的转移取决于肿瘤细胞(种子)和靶器官的微环境(土壤)之间的相互作用。此假说一经提出,即成为解释肿瘤器官特异性转移的重要理论依据。在此之后的许多研究都支持种子和土壤假说的真实性,并在此基础上发展出了更多新的理论。2005年,罗塞德·卡普兰(Rosandra Kaplan)在自然杂志上发表论文,在种子与土壤理论的基础上提出“肿瘤转移前期”(pre-metastatic nich)的概念。他认为,肿瘤转移之前,一群VEGFR1阳性的骨髓细胞会先一步聚集在靶器官,以旁分泌细胞因子或者通过整合素与基质相互作用的方式改变靶器官的微环境,从而为肿瘤细胞的到来准备好一个舒适的温床。卡普兰的肿瘤前转移理论为解释肿瘤的器官特异性转移打开了一扇新的大门,使人们的目光更多地集中到肿瘤转移前靶器官微环境的变化上来。乳腺癌是最常见的肿瘤之一,其发病率在我国女性人群中排名第一。肿瘤转移造成的死亡是乳腺癌最主要的致死原因。乳腺癌可以向多器官转移,而肺、肝脏和骨是其最常转移的部位,发生转移的风险高于其他器官,是乳腺癌器官特异性转移的靶器官。乳腺癌为何更倾向于转移到上述器官?在卡普兰提出肿瘤前转移理论之前,已有许多研究试图对此行为背后的机制做出解释,主要观点有几种,一是某个或某几个基因的异常决定了肿瘤转移的生物学行为,二是基于配体受体和理论,认为肿瘤转移的行为取决于肿瘤分泌的特异性细胞因子或受体与靶器官的相互作用,三是以上两种理论的综合。肿瘤前转移理论为乳腺癌器官特异性转移的研究开启了新的思路,近几年来,已经有越来越多的研究是基于肿瘤转移前期的基础之上,并逐渐验证了此理论的真实性。基于以往的研究,我们认为肿瘤转移前期靶器官微环境的炎症反应可能对乳腺癌的器官特异性转移有重要作用。乳腺癌细胞定植到靶器官是一个复杂的过程,我们的研究所关注的是其中的某个关键步骤,即乳腺癌细胞在血液循环的过程中粘附并穿出血管的过程,并探索靶器官微环境的炎症反应对这一过程的影响。我们认为这种影响可能体现在两个方面,一是改变靶器官微血管内皮细胞的结构,使细胞通透性增大,利于肿瘤细胞的穿出,二是原发肿瘤分泌的炎症因子可能通过某种分子机制对血管壁产生影响,利于肿瘤的贴壁。这两个假设是本实验研究的基础,而我们研究的最终目的就是验证假设真实性以及探索其背后可能的机制。第一部分4T1小鼠肿瘤转移模型中靶器官发生转移前期的炎症反应研究目的1.确定4T1小鼠肿瘤转移模型转移前期发生的时间范围。2.验证转移前期小鼠肺部的炎症反应和通透性变化。3.验证转移前期小鼠肝部发生局部炎症反应。研究方法1.建立4T1小鼠肿瘤转移模型：用BALB/c小鼠和4T1乳腺癌细胞建立小鼠乳腺癌原位转移模型：使用6-8周的雌性BALB/c小鼠,每8-10只为一组；在小鼠第四对乳腺处皮下注射4T1细胞,每侧5×105个。2. 确定乳腺癌肿瘤前转移发生的时间范围：初步确定乳腺癌前转移发生的时间范围：用BALB/c小鼠和4T1乳腺癌细胞建立肿瘤转移模型,自接种后一周起,每隔2-4天解剖一组小鼠,查看器官转移情况。精确确定乳腺癌前转移发生的时间范围：用病毒转染4T1细胞,使其表达红色荧光(RFP-4T1);将RFP-4T1细胞用上述方法种植在BALB/c小鼠乳腺,自接种一周起,每隔2-4天解剖一组小鼠,镜下观察组织冰冻切片,查看转移情况。3. 检测炎症反应：将组织器官切片进行HE染色,镜下观察组织形态。4.血管通透性试验：通过尾静脉向前转移期的BALB/c小鼠体内注射结合罗丹明的低分子右旋糖酐(rhodamine-conjugated dextran,70 kD),4 h后以同样方法注射结合绿色荧光蛋白的凝集素(FITC-lectin),30 min后用生理盐水进行心脏灌洗。灌洗完毕解剖小鼠,取出肺组织进行冰冻切片,镜下观察并拍照。5. Western blot和荧光定量PCR法检测紧密连接蛋白的表达。6. 用免疫荧光染色法检测转移前期小鼠肺部紧密连接蛋白分布：取前转移期小鼠以及对照组小鼠的肺组织做成冰冻切片,免疫荧光染色后镜下观察。结果1.4T1小鼠肿瘤转移模型的生长过程：4T1细胞原位种植一周后,乳腺处长出约黄豆粒大小的原位瘤,肺部无明显改变；10天后,原位瘤生长至蚕豆粒大小,部分小鼠肺部可见炎性改变；肿瘤种植后12天,半数小鼠出现炎症反应；种植肿瘤后14天,个别小鼠肺部可见转移瘤；20天后,原位瘤体积明显增大,多数小鼠肺部可见转移瘤。根据上述试验结果,我们将乳腺癌转移前期初步界定在原位种植后第10-12天。将RFP-4T1细胞原位注射后,我们分别于第12天、第14天和第16天解剖小鼠并切片观察,发现代表转移瘤的红色荧光斑最早出现在第14天的小鼠肺部,而HE染色显示炎症表现最早出现在第10天的小鼠肺部。2.转移前期小鼠肺部通透性变化：结合罗丹明的低分子右旋糖酐可以穿过毛细血管的细胞间隙,渗透入血管周围组织,在荧光显微镜下显示红色；结合绿色荧光蛋白的凝集素可以与血管壁结合,显示血管结构。对比转移前组和对照组的肺部冰冻切片,可见转移前组红色荧光明显增多。3.紧密连接相关蛋白在转移前期的小鼠肺部的变化：检测Occludin、ZO-1、 Claudin-5、Claudin-1和Claudin-4这几种紧密连接蛋白的表达量在转移前期小鼠肺部的变化。Occludin和ZO-1在转移前期的小鼠肺部表达明显减少；Claudin-5大量存在于小鼠肺组织中,但是其表达变化不明显；Claudin-1和Claudin-4在小鼠肺组织中表达量较少,且变化并不明显。粘附连接蛋白β-catenin、E-cadherin和VE-cadherin的表达无明显变化。免疫荧光显示Occludin和ZO-1在小鼠肺部存在异常分布。4.转移前期小鼠肝脏出现炎症反应：植肿瘤后14天,发现小鼠肝脏发生镜下改变,种植肿瘤后16天,部分小鼠的肝脏观察到局部炎症反应。免疫组化显示肝组织E-selectin染色阳性。结论1.4T1小鼠肿瘤转移模型,肿瘤转移前期时间范围被确定为4T1细胞原位种植后的第12天之前。2.组织HE染色和免疫组化染色证明转移前期小鼠肺和肝脏存在局部炎症反应。3.血管通透性试验证明转移前期小鼠肺毛细血管通透性增加。4.紧密连接相关蛋白Occludin和ZO-1在转移前期小鼠肺部表达减少。5.转移前期小鼠肝脏炎症反应出现的时间晚于肺。免疫组化显示转移前期小鼠肝组织E-selectin染色阳性。第二部分探讨转移前期小鼠靶器官炎症反应产生的机制研究目的1.验证转移前期小鼠血清中是否存在某一种或几种表达水平异常增高的细胞因子,而原发肿瘤的分泌是否是导致这种细胞因子血清水平增高的原因。2.分析此异常增高的细胞因子是否可能是导致前转移期小鼠肺部紧密连接蛋白表达发生变化的原因。3.验证此细胞因子是否与前转移期小鼠肺部毛细血管通透性增加有关。4. 验证紧密连接蛋白的表达异常是否会导致小鼠肺部毛细血管通透性增加。5.验证VEGF下游通路是否与肺内皮细胞通透性的变化相关。研究方法1.用蛋白芯片和ELISA方法检测转移前期小鼠血清中细胞因子的水平。用Western blot检测原发肿瘤内部细胞因子的表达。ELISA方法检测培养的4T1细胞中该细胞因子的表达情况。2.分离并体外培养BALB/c小鼠肺血管上皮细胞。3.用VEGF处理小鼠肺血管内皮细胞,用Western blot法检测紧密连接蛋白的表达。用荧光定量PCR测定小鼠肺血管内皮细胞紧密连接蛋白相对应的mRNA含量。用免疫荧光染色法观察VEGF处理后小鼠肺血管内皮细胞紧密连接蛋白的表达。4.通过transwell试验,验证VEGF处理后小鼠肺血管内皮细胞通透性是否改变。应用细胞因子抑制剂后,检测前转移期小鼠肺部毛细血管通透性的变化。5. VEGF处理小鼠肺血管内皮后,用Western blot方法检测各个下游通路变化情况。找出变化最明显的通路,进一步验证。加入通路抑制剂,验证该通路的激活与Z0-1表达的关系。结果1.用蛋白芯片和ELISA方法检测了12种相关的细胞因子在转移前期组小鼠和对照组小鼠血清中的表达水平,结果显示和对照组相比转移前期组小鼠血清中VEGF的水平明显增高。ELISA方法检测表明4T1乳腺癌细胞可以分泌大量VEGF。2. 用VEGF处理培养的肺血管内皮细胞,Western blot和荧光定量PCR结果显示紧密连接蛋白ZO-1表达水平降低。肺血管内皮细胞爬片经免疫荧光染色后显示,VEGF处理组ZO-1荧光表达减少。3. transwell试验结果显示VEGF处理后的小鼠肺血管内皮细胞通透性增加。4.对前转移期小鼠应用VEGF的抑制剂后,小鼠肺部毛细血管通透性降低。5. VEGF处理小鼠肺血管内皮后,PKC通路活跃性增强。PKC通路抑制剂可以逆转VEGF引起的ZO-1的表达下降。结论1.原发肿瘤可分泌VEGF并释放入血液循环,导致VEGF血清水平升高。2.血清VEGF水平升高导致前转移期小鼠肺血管内皮紧密连接蛋白特别是Z0-1表达减少,从而导致小鼠肺部毛细血管通透性增加。3. VEGF对ZO-1表达的影响可能通过PKC通路起到作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-37
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本文编号：
2292173
