癌基因Kras在非酒精性脂肪性肝病及其向肝癌转化中的作用与机制研究

发布时间：2018-10-29 09:50

【摘要】：研究背景与目的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是肝癌发生的一个独立危险因素,随着肥胖和糖尿病的逐年增多,其发生率也是成指数级上升。肝脏脂肪代谢异常、脂代谢相关基因的失调控与NAFLD、非酒精性脂肪肝炎(NASH)及肝癌的发生密切相关。现已证明,Ras通路的激活已普遍存在于人类肝细胞癌中,然而,Ras通路的激活与肝癌中肝脏脂代谢异常之间的关系并不十分清楚。遂本课题旨在研究癌基因Kras对肝脏脂代谢的影响,探讨它对脂代谢的调控与肝癌发生的关系及NAFLD向肝癌转化过程中的作用。为寻找肝病患者的早期干预靶标提供理论基础。实验方法及步骤1.野生型小鼠非酒精性脂肪性肝病模型的建立将野生型小鼠(wild type)在成年后,喂养60%的高脂饮食建立NAFLD模型。检测其肝脏组织Ras下游通路的表达水平。2.Kras突变转基因小鼠的繁殖与鉴定Kras~(G12D)嵌合lox P系统小鼠由中国人民解放军军事医学科学院八所杨晓主任实验室引入,而白蛋白(Alb)启动子嵌合Cre小鼠(Alb-cre)由南京模型动物中心购置。将引入的Found鼠与Alb-Cre小鼠饲养交配,利用Cre-lox P系统的脏器特异性敲入靶基因功能制造Kras肝脏特异性突变小鼠(Kras~(G12D)),用于后续的实验研究。3.转基因小鼠的单纯饮食肥胖模型选定肝脏特异性Kras~(G12D)突变鼠以及同窝对照小鼠,在其出生后8周时进行高脂饮食或对照饮食的喂养。每周固定时间称量一次体重,并确保食物均是过量给予,连续喂养16周或20周后取材,检测脂肪肝及肝癌相关指标。小鼠血清ALT和AST水平测定检测肝功情况;小鼠HE染色,检测肝脏的组织结构、脂肪变性及癌变程度;体重、肝重、外周脂肪标志肥胖模型的整体情况;肝脏组织甘油三酯及总胆固醇含量的分析,检测肝脏内脂肪的累积情况;肝组织游离脂肪酸含量检测肝脏内脂肪的成分;葡萄糖耐量实验,反应活体下的胰岛素抵抗情况;ki67染色检测肝细胞的增殖情况;Epcam?CD44,CD105,CD90分子的染色检测肝脏中肿瘤起始细胞的表达情况;收集肝组织RNA,利用RT-PCR,检测炎症因子以及巨噬细胞的侵润情况;Western blot检测Ras相关通路的活化。4.高脂饮食联合二乙基亚硝胺的快速诱癌模型将肝脏特异性Kras~(G12D)突变鼠出生第15天时,按照25mg/kg的剂量腹腔注射DEN。并于8周龄时进行高脂饮食或对照饮食的喂养。每周固定时间称量一次体重,并确保食物均是过量给予,连续喂养10周或17周后取材,观察各组之间的成瘤情况。5.机制探询(1)小鼠代谢笼检测Kras~(G12D)突变鼠与野生型小鼠,在新陈代谢等整体机能水平上的差异(2)Western blot、RT-PCR、免疫组化检测各组小鼠肝脏组织中,脂肪酸合成以及脂肪酸β氧化相关分子的表达情况(3)组织试剂盒检测各组小鼠肝脏的活性氧簇,总谷胱甘肽以及氧化性谷胱甘肽的含量。(4)Western blot检测各组小鼠肝脏组织中DNA损伤修复以及细胞凋亡分子的表达情况(5)免疫组化辅证小鼠肝脏组织中DNA损伤与修复情况(6)体内注射CPT1A抑制剂(etomoxir),观察抑制肿瘤的效果实验结果野生型小鼠NAFLD形成过程中,肝脏组织中Ras下游通路活化;而且,肝内特异性过表达Kras的小鼠在NAFLD形成过程中,其下游通路进一步被激活;因此本研究旨在探索Kras在非酒精性脂肪性肝病及其向肝癌恶性转化中的作用机制。我们通过培育肝脏特异性Kras~(G12D)突变型小鼠,在其出生后6-8周龄时喂养高脂饮食饲料(HFD)以及正常对照饲料(ND)。与对照相比,我们发现高脂饮食下的Kras~(G12D)小鼠最早出现肝细胞癌,肝脏肿瘤数目以及最大直径显著增多;肝细胞增殖以及肿瘤起始细胞表面标志物表达显著升高;此外,在高脂饮食下,Kras~(G12D)小鼠体重明显轻于对照(WT)小鼠。我们检测了脂肪肝相关系列指标,发现与对照小鼠相比,Kras~(G12D)小鼠的肝重,肝内甘油三酯及游离脂肪酸水平均较低,提示在Kras~(G12D)小鼠中高脂饮食引起的脂肪肝效应较轻。我们进一步利用体重未出现差异之前的两组小鼠进行探究,发现Kras~(G12D)小鼠的基础代谢率较高,且脂肪酸从头合成途径中的关键分子(如:ACC1,SCD1等)表达较低,在转录水平,促进脂肪酸氧化的相关基因(CPT1A,PPARα,ATGL,AOX等)均在高脂Kras~(G12D)小鼠中显著上调,在蛋白水平,脂肪酸β氧化的关键限速酶(CPT1A)上调明确,推测可能是因为Kras~(G12D)肝内具有过度的脂肪酸氧化效应导致肝内的脂肪堆积减少,与此同时,Kras~(G12D)小鼠在高脂饮食喂养下,其肝内出现了明显的氧化应激,即肝内总ROS,以及GSSG上升,GSH下降,γ-H2AX,P53BP1,MDA相关氧化损伤应答指标表达上调,凋亡相关信号通路也表达增高。推测可能是由于肝内过度脂肪酸氧化导致了氧化应激加重,从而在后期促进了肿瘤形成,故我们使用了CPT1A的抑制剂etomoxir,在给予腹腔注射5周后,发现其有明显抑制肿瘤的效果。至此本研究提示Kras可通过促进肝内脂肪酸的β氧化减轻HFD诱导的NAFLD形成,但加重氧化应激,进而促进了肝细胞癌的发生;并提示CPT1A可作为肝癌治疗中的一个潜在干预靶点。结论在高脂饮食环境下,Kras可通过抑制脂肪酸的合成以及促进脂肪酸的β氧化从而减轻高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝,但促进肝细胞增殖及肝癌干细胞标志物表达,加重氧化应激及DNA损伤,加速肝癌的发生发展。本文阐述了Ras对肝脏脂质代谢的调控及其对肝癌发生的影响,为寻找肝病患者的早期干预靶标提供了理论基础。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575.5;R735.7

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