MYH9在大肠癌中的表达及RNA干扰对大肠癌生物学行为的影响

发布时间：2018-10-29 16:29

【摘要】：大肠癌又称为结直肠癌（colorectal cancer，CRC），是一种常见的消化道恶性肿瘤。在西方国家，CRC是一种常见的致死性疾病,每年有超过百万人被诊断为CRC并且大约一半的人因此死亡。CRC是美国恶性肿瘤的第二位。在我国，CRC居恶性肿瘤的第四位。肿瘤的浸润程度、是否发生淋巴结和远处转移是决定其预后的一个重要的因素，原位癌（I期）的5年生存率超过90％，而转移到远处器官（IV期）时，5年生存率仅为约10％。显然需要一种更好的生物标志物，以改善对CRC的筛查和诊断效果。II期和III期的大肠癌患者手术切除后是否应接受辅助化疗以及进行何种化疗，都影响其预后。对于已经发生转移的CRC（IV期）患者来说，虽然已失去手术切除的指征，但仍然存在是否进行“传统”化疗与新的生物治疗相组合，以延长生存期的选择。因此，找到新的的生物标志物用于预测患者对化疗药物的反应也迫在眉睫。蛋白质组学的概念自提出以来，己广泛的应用于医学的各个领域，并取得了许多开创性的成果。近年来，蛋白质组学技术的快速发展使其在各种恶性肿瘤的研究中也有广泛应用，为我们进一步了解肿瘤的发病机制以及开展肿瘤的个体化治疗提供了一种新的手段。本研究旨在应用蛋白组学的方法研究大肠癌肿瘤组织与癌旁组织之间蛋白表达谱的差异，从而建立大肠癌的差异表达谱，以期筛选出可用于大肠癌辅助诊断的生物标记物。在本研究中不能对筛选出的所有差异蛋白做深入研究，因此从差异表达蛋白谱中选取MYH9作为目标蛋白，采用Western Blot的方法验证了其表达情况，并构建慢病毒表达载体，观察RNA干扰MYH9基因的表达对大肠癌细胞系SW480的增殖、凋亡、细胞周期以及细胞亚结构等的影响，从而进一步了解MYH9的生物学功能。本研究共分为三部分第一部分：TNM Ⅲ期大肠癌与癌旁组织的差异蛋白谱的建立方法： 1、选取25例TNM Ⅲ期大肠腺癌患者术中切除的肿瘤组织标本及配对的癌旁正常组织标本作为研究对象。所用癌旁组织均取自癌组织上端，且距离癌组织均大于10厘米。所有患者术前均未接受任何化疗和放疗，且肿瘤组织标本术后均经病理学证实为TNM Ⅲ期腺癌。术中切除的组织经PBS冲洗放入液氮速冻，再置于-80℃冰箱保存。 2、提取肿瘤组织和癌旁组织中的总蛋白，并分析组织的蛋白质浓度。 3、制备蛋白水解多肽混合物。 4、采用二维液相色谱法进行样本的分离。 5、通过LTQXL离子肼质谱仪对二维色谱洗脱的多肽进行检测。 6、对质谱数据进行生物信息学分析，找到癌组织与癌旁组织差异表达的蛋白质。结果： 1、经二维色谱与质谱联用的分析，在大肠癌组织标本中共获得了579个蛋白点；癌旁组织中共获得了492个蛋白质点。将这些蛋白点进行比对，并经数据库检索，发现癌组织与癌旁组织差异表达的蛋白质共有35个。 2、在肿瘤组织中上调表达的25个蛋白质分别是： FBLN1、 MYH9、TPM4、FGA、GSTP1、HIST1H3J、IGHA1、SERPINH1、TUBB3、IGHA1、TPM3、 CKAP4、 IGHA2、 POSTN、 FGB、 FGG、 PKM2、 HIST1H2AE、MYH10和TUBB。 3、在肿瘤组织中下调表达的10个蛋白质分别是： SYNM、 MYH11、PKM2、 KRT10、 FLNC、 H2AFX、 CAP1、 MYL6、 TUBB2A、 TLN1、TGFB1I1、VCL、SYNM、ACTC1和CNN1。 4、通过本次研究我们建立了大肠癌组织和癌旁组织的差异表达蛋白谱，为进一步深入研究大肠癌的发病机制等提供实验数据。 5、从差异表达蛋白谱中选取MYH9作为目标蛋白进行后续研究。第二部分验证MYH9在大肠癌中的表达方法：选取30例原发性大肠癌组织标本和30例配对癌旁组织标本，用Western Blot的方法鉴定目标蛋白MYH9在大肠癌组织及癌旁组织中的表达情况。结果：经Western Blot证实大肠癌组织中MYH9的表达量显著高于癌旁组织(P0.05)，这也在一定程度上验证了第一部分蛋白质组学结果的可靠性。第三部分：RNA干扰对大肠癌生物学行为的影响方法： 1、培养SW480细胞株，对其进行免疫荧光染色，在荧光显微镜下观察MYH9在SW480细胞内的定位及表达情况。 2、从GenBank中提取MYH9基因序列，构建针对MYH9靶序列的GV248慢病毒载体MYH9siRNA。 3、使用大提质粒试剂盒提取质粒，用分光光度计测定提取质粒的OD260数值，计算质粒DNA的浓度；分别在260nm和280nm测定溶液的吸光度值，计算OD260/280比值确定质粒DNA的纯度。 4、用GenEscortTMⅡ基因转染试剂盒进行转染。我们构建的GV248慢病毒载体内携带表达EGFP的基因，荧光显微镜下观察转染阳性的细胞会呈现明亮的绿色荧光，通过转染细胞中绿色荧光蛋白的表达量来确定细胞的转染效率。 5、Real-Time PCR法检测MYH9siRNA对SW480细胞MYH9mRNA表达量的影响。 6、对SW480细胞株进行免疫荧光染色，在荧光显微镜下观察Control质粒转染的SW480细胞、psiMYH9质粒转染的SW480细胞内MYH9蛋白的表达情况。MYH9蛋白在SW480细胞中表达呈红色荧光，根据红色荧光的荧光强度变化，确定细胞MYH9蛋白的表达量，并对二者的差异进行统计学分析。 7、采用cck8法进行细胞增殖实验，观察psiMYH9转染对SW480细胞增殖的影响。 8、采用流式细胞术检测psiMYH9转染后细胞周期的改变，与Control质粒转染的SW480细胞的细胞周期进行比较，对各期细胞数的差异进行统计学分析。采用Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒检测psiMYH9转染后SW480细胞的凋亡指数，并与Control质粒转染的SW480细胞的凋亡指数进行比较，对其差异进行统计学分析。用荧光显微镜观察：凋亡细胞和坏死细胞都会被Annexin V-PE染成红色，而正常细胞不会被Annexin V-PE染色。我们构建的慢病毒表达载体可表达绿色荧光蛋白，因此成功转染后的细胞会呈现绿色荧光。 9、电镜下观察psiMYH9转染组、对照质粒转染组SW480细胞的亚结构。结果： 1、荧光显微镜下可见MYH9蛋白阴性表达的SW480细胞内由Hoechest33342染色的细胞核呈现蓝色荧光，细胞浆不着色。MYH9蛋白阳性表达的细胞细胞核呈现蓝色荧光，细胞浆呈现红色荧光。MYH9蛋白定位于SW480细胞的细胞浆，为高等强度表达。 2、成功获得能够高效转染SW480细胞的慢病毒重组表达载体。针对靶序列MYH9-RNAi(26358)的慢病毒载体命名为psiMHY9-1；针对MYH9-RNAi(26359)靶序列命名为psiMHY9-2；针对MYH9-RNAi(26360)靶序列命名为psiMHY9-3；针对MYH9-RNAi(26361)命名为psiMHY9-4。 3、RNA干扰对MYH9基因转录水平的影响：转染psiMYH9-2质粒组MYH9基因转录水平显著下降，与control质粒转染组相比，差异有统计学意义（P0.01）。转染psiMYH9-1、 psiMYH9-3、psiMYH9-4质粒组MYH9基因转录水平与转染Control质粒组相比差异没有统计学意义（P0.01）。在构建的4个慢病毒载体中以psiMYH9-2对MYH9基因表达的抑制作用最强。因此，在接下来对MYH9的功能的研究中我们应用psiMYH9-2进行实验。 4、RNA干扰对MYH9蛋白表达的影响：psiMYH9-2质粒转染组MYH9蛋白表达明显低于转染control质粒组，将二者进行比较，差异具有统计学意义（P 0.05）。 5、RNA干扰对细胞增殖的影响：在RNAi质粒转染24h时，psiMYH9-2质粒转染组细胞存活率与转染control质粒组和正常培养的SW480细胞相比明显降低，差异均有统计学意义(P0.01，P0.01)。在RNAi质粒转染48h时，psiMYH9-2质粒转染组细胞存活率与转染control质粒组和正常培养的SW480细胞相比也明显降低，差异有统计学意义(P0.01，P0.01)。 48h与24h时细胞的存活率没有明显差别(P㧐0.05)。 6、RNA干扰对细胞周期的影响： psiMYH9-2转染组的G1期细胞的比例增加,与control组相比差异有统计学意义（P 0.001）；S期细胞的比例无明显差别，与control组相比差异无统计学意义（P㧐0.05）；G2期的比例减少，与control组相比差异有统计学意义（P 0.01）。 7、RNA干扰对细胞凋亡的影响：转染control质粒的SW480细胞组偶见凋亡细胞，转染psiMYH9-2的细胞，红色荧光细胞明显增多，具有早期凋亡特征的细胞偶见，凋亡晚期和坏死的细胞多见。 pControl质粒转染组和psiMYH9-2质粒转染组SW480细胞凋亡指数分别为6.53±1.67%和18.48±3.66%，psiMYH9-2转染组明显高于转染control质粒组，经统计学分析，二者的差异具有统计学意义（P 0.01）。 8、RNA干扰对细胞亚结构的影响：转染pControl质粒的SW480细胞，细胞核多为圆形和不规则圆形，染色质均匀分布，核仁清晰，，核质比大，细胞膜边缘清晰，细胞器结构完整。 psiMYH9-2质粒转染后SW480细胞的细胞核内异染色质增多和边集，核固缩，常染色质减少，细胞核空化。细胞浆可见内质网腔扩张，出现次级溶酶体，内含残缺线粒体，胞浆可见质地不均、高电子密度及空泡状物质。与转染pControl质粒的SW480细胞相比，亚结构发生了明显变化。通过以上研究，我们得出以下结论： 1.本研究成功建立了TNM Ⅲ期大肠癌组织与癌旁组织的差异蛋白谱。 2.验证了大肠癌组织中MYH9的表达量显著高于癌旁组织。 3.成功构建了沉默MYH9基因的GV248慢病毒表达载体，并成功转染大肠癌SW480细胞。 4. RNA干扰MYH9基因的表达后大肠癌的生物学行为发生了明显的改变：SW480细胞中MYH9mRNA以及MYH9蛋白的表达量明显减低、SW480细胞的增殖受到明显抑制、凋亡显著增强、细胞周期和亚结构也发生了明显改变。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34

【参考文献】