新型肝靶向纳米多肽递送系统的构建及性能评价

发布时间：2018-10-30 20:44

【摘要】：肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是一个全球公共健康难题,常规治疗策略的效果不尽如人意。基因治疗为肝癌尤其是进展期肝癌的治疗带来了一线曙光,截止目前共有17项肝细胞癌基因治疗临床试验正在进行,有望成为肝癌的克星。基因治疗载体决定了治疗基因表达的特异性和效率,对它的设计和构建是基因治疗的关键因素和研究难点。基因治疗载体要保护治疗基因免遭核酸酶破坏,并能够特异性识别和进入靶细胞,之后还要面临复杂的细胞内环境,完成“逃离内吞体”、避免“溶酶体降解”、定位到细胞核并启动治疗基因表达等一系列极具挑战的任务。近年来,人工设计仿生载体(Designer biomimetic vector, DBV)作为基因治疗载体备受瞩目。一个高效的仿生载体包括核酸浓缩基序(DNA condensing motif, DCM)、靶向肽段(Targeted peptide,TP)、内吞体裂解基序(Endosome disrupting motif, EDM)、核定位信号(Nuclear localization signal, NLS)等基本要素。DBV通过DCM与治疗基因自组装成纳米尺寸的颗粒,防止血清中核酸酶对治疗基因的降解；TP的靶向作用可以经受体介导的内吞途径将基因治疗载体携带至靶细胞内；而EDM能够破坏内吞体膜将基因治疗载体从内吞体释放至胞浆中,并通过NLS的核定位作用将其定位至胞核实现治疗基因的高效表达。本人所在的课题组既往的研究证实来源于疟原虫环子孢子蛋白(Circumsporozoite protein, CSP)的CSR2a肽段是一个新的理想的肝特异性靶向配体分子,对构建高效的肝癌基因治疗靶向递送系统具有较高的研究价值。另外,我们前期通过分析、鉴定获得了一种新型肿瘤特异性启动子-FZD7(Frizzled-7)启动子,研究证实其具有突出的肝癌特异性和转录调控活性。目的在本研究中,我们以CSR2a作为特异配体设计、构建及评价了一种新型肝靶向纳米多肽递送系统,为进一步实现FZD7启动子调控下的肝癌精准治疗奠定基础。方法1.设计并利用基因工程重组技术制备基于CSR2a小肽的肝靶向递送DBV。用免疫印迹实验验证His-tag;采用红细胞溶血和组织蛋白酶D酶切位点鉴定实验,检测DBV pH依赖的内吞体胞膜裂解功能及靶向配体分子的释放效应。2.将DBV与质粒pEGFP-N1进行混合,对影响包裹率的缓冲液、孵育温度及孵育时间等因素进行分析；利用琼脂糖凝胶电泳、Zeta电位仪、Nanosight纳米颗粒分析仪和透射电子显微镜等对所形成纳米颗粒的粒径、负载电荷、pH稳定性、中和效应等表征进行分析。3.通过血清稳定性实验、靶向肽段抑制试验和细胞毒性实验分析纳米粒子DBV/pEGFP-N1的抗核酸酶降解能力、肝靶向性、细胞毒性等性能；最后,采用体外细胞实验、动物体内实验验证DBV的肝靶向递送功能。结果1.成功制得8种较高纯度的DBV,其中只有DBV3的靶向肽段可被切除,被用于后续实验；pH 7.4时DBV3不会使红细胞裂解,而pH 5.5时发生裂解,证实了DBV3在酸性条件下具有胞膜裂解能力。2.室温或者37℃条件下,在pH 5.5的醋酸盐缓冲液中N/P(氮磷比)为10时,孵育1h更利于纳米颗粒的自组装,包裹率达到(99.1±0.7)%,所形成的DBV3/pEGFP-N1球形纳米粒子水合粒径为132±3.1 nm,负载电荷为+28.5+1.3 mV。3. DBV3/pEGFP-N1纳米粒子中的pEGFP-N1质粒不会被血清中的核酸酶降解；靶向肽CSR2a与细胞孵育后,可以竞争性抑制DBV3/pEGFP-N1的肝靶向性能；DBV3/pEGFP-N1对细胞没有明显的毒性效应,且可以靶向进入正常肝细胞和肝癌细胞；硫酸长春新碱可以抑制DBV3/pEGFP-N1向核运输；体内递送实验中,正常肝组织中有明显荧光,而心、肾、脾、胃等组织中并未有荧光蛋白表达。结论本研究成功构建了一种以CSR2a小肽作为特异性肝靶向配体的新型肝靶向纳米多肽递送系统,包含了DCM、EDM、NLS和CSR2a等功能元件,能够在体外与DNA质粒自组装成稳定的纳米粒子,保护DNA质粒不被血清核酸酶降解,与靶向肝细胞特异性结合,通过内吞作用进入细胞,能从溶酶体中释放入细胞质,并在NLS的引导下定位到细胞核,成功表达了目的基因。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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本文编号：2301129