Bin1在非小细胞肺癌中的功能及其机制研究

发布时间：2018-11-02 15:38

【摘要】：第一部分目的:检测桥接整合因子-1(bridging integrator-1,Bin1)在H1975、H1650、A549、H460四种人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞和正常人胚肺成纤维细胞2BS细胞中的表达情况,筛选出Bin1低表达的非小细胞肺癌细胞;构建Bin1稳定过表达的慢病毒载体质粒,研究Bin1过表达对NSCLC细胞系H1975细胞的增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法:1采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantificational real-time polymerase chainreaction,qRT-PCR)方法和Western blot实验检测Bin1在H1975、H1650、A549、H460四种人非小细胞肺癌细胞和人胚肺成纤维细胞2BS细胞中的表达情况,筛选出Bin1低表达的非小细胞肺癌H1975细胞。2构建携带Bin1基因的慢病毒载体p CDH-Bin1,体外以病毒转染的方式将Bin1基因转入H1975细胞(Bin1+组),并分别设置空载体组(p CDH组)和空白对照组(Con组),流式细胞术分别筛选出稳定表达Bin1和空载体的H1975细胞,扩大培养后,经qRT-PCR和Western blot方法鉴定,获得稳定过表达Bin1的H1975细胞系。3利用MTT实验和平板克隆形成实验检测Bin1对H1975细胞增殖能力的影响。4流式细胞术检测Bin1对H1975细胞细胞周期的影响。5细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测Bin1对H1975细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:1 qRT-PCR和Western blot实验结果表明,与人胚肺成纤维细胞2BS细胞相比,H1975、H1650、A549中Bin1基因和蛋白的表达水平明显低于2BS细胞中Bin1基因和蛋白的表达水平,其中H1975细胞中Bin1基因和蛋白表达量最低(P0.05),而H460中Bin1基因和蛋白表达量与2BS细胞相比差异无统计学意义(P0.05)。筛选出Bin1表达量最低的H1975细胞,用于后续实验。2 qRT-PCR和Western blot实验结果表明,与p CDH组和Con组相比,Bin1+组H1975细胞中Bin1基因和蛋白表达水平显著升高(P0.05),p CDH组和Con组相比,Bin1基因和蛋白的表达水平差异无统计学意义(P0.05),说明Bin1已成功转入H1975细胞中。以流式细胞术筛选的方式获得稳定过表达Bin1的Bin1+细胞和稳定表达p CDH载体的p CDH组细胞。3 MTT实验结果表明,在H1975细胞中,Bin1+组细胞在24h、48h、72h、96h、120h增殖率分别为0.0543±0.021,0.1249±0.034,0.2348±0.027,0.3594±0.019,0.4923±0.031;p CDH组细胞在24h、48h、72h、96h、120h增殖率分别为0.0634±0.024,0.3549±0.037,0.4988±0.047,0.9857±0.019,1.524±0.053;Con组细胞在24h、48h、72h、96h、120h增殖率分别为0.0619±0.029,0.3624±0.042,0.4874±0.039,0.9957±0.023,1.5097±0.046。与p CDH组和Con组相比,Bin1在48h、72h、96h、120h可以抑制H1975细胞的增殖活性(P0.05),而p CDH组和Con组细胞的增殖活性相比差异无统计学意义(P0.05),说明Bin1可以抑制H1975细胞的增殖活性。平板克隆形成实验结果表明,相同条件培养7天后,Bin1+组细胞克隆形成能力为p CDH组的59%(P0.05),为Con组的61%(P0.05),而p CDH组和Con组细胞的克隆形成能力相比差异无统计学意义(P0.05)。说明Bin1可以抑制H1975细胞的克隆形成能力。以上实验结果表明Bin1可以抑制H1975细胞的增殖能力。4细胞周期实验结果表明,Bin1+组细胞G0/G1期比例为(67.12±1.74)%,p CDH组细胞G0/G1期比例为(55.81±1.48)%,Con组细胞G0/G1期比例为(56.41±2.03)%,与p CDH组和Con组相比,Bin1+组细胞G0/G1期比例显著增加(P0.05),而p CDH组和Con组相比G0/G1期比例差异无统计学意义(P0.05),说明Bin1+组细胞中DNA合成受限,阻止细胞从G0/G1期进入S期,进而诱导H1975细胞发生细胞周期阻滞。5细胞划痕实验结果显示,Bin1+组细胞12h迁移距离为(25.3±2.6)μm,p CDH组细胞12h迁移距离为(58±5.2)μm,Con组细胞12h迁移距离为(60.21±4.2)μm;Bin1+组24h迁移距离为(58.7±3.8)μm,p CDH组24h迁移距离为(92.3±4.3)μm,Con组24h迁移距离为(89.7±5.8)μm。与p CDH组和Con组相比,Bin1+组迁移变化在12h及24h后均有统计学意义(P(27)0.05),且细胞迁移距离明显缩短(P(27)0.05);而p CDH组和Con组相比,划痕12h及24h后细胞迁移变化均无统计学意义(P0.05),说明Bin1能够抑制H1975细胞的迁移能力。Transwell实验显示,Bin1+组、p CDH组、Con组穿膜细胞数分别为50.50±3.15、124.00±4.25、130±4.37,与p CDH组和Con组相比,Bin1+组穿膜细胞数明显降低(P0.05),而p CDH组和Con组相比,两者差异无统计学意义(P0.05),说明Bin1能够降低H1975细胞的侵袭能力。第二部分目的:检测程序死亡因子受体(programmed death ligand 1,PD-L1)在H1975、H1650、A549、H460四种人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞和人胚肺成纤维细胞2BS细胞中的表达情况,通过过表达和RNA干扰两种方式研究Bin1对免疫抑制因子PD-L1表达水平的影响,分析Bin1抑制NSCLC免疫逃逸的相关机制。方法:1 qRT-PCR和Western blot实验检测PD-L1在H1975、H1650、A549、H460四种人非小细胞肺癌细胞和人胚肺成纤维细胞2BS细胞中的表达情况,并检测Bin1对H1975细胞中PD-L1表达的影响。2构建Bin1-si RNA,将其转染入人H460细胞(Bin1-si RNA组)中,并设置空白对照组(Con组),通过qRT-PCR及Western blot实验检测RNA干扰效果,同时用qRT-PCR、Western blot方法检测敲除Bin1对PD-L1表达水平的影响。3构建c-MYC-si RNA,qRT-PCR和Western blot实验检测RNA干扰效果,并检测敲除c-MYC对PD-L1表达水平的影响。结果:1 qRT-PCR和Western blot实验结果表明,与人胚肺成纤维细胞2BS细胞相比,H1975、H1650、A549细胞中PD-L1基因和蛋白的表达水平明显高于2BS细胞中PD-L1基因和蛋白的表达水平,其中H1975细胞中PD-L1基因和蛋白表达量最高(P0.05),而H460和A549细胞中PD-L1基因和蛋白表达量与2BS细胞相比差异无统计学意义(P0.05)。结合第一部分第一个结果,筛选出Bin1表达量最低而PD-L1表达量最高的H1975细胞,用于后续实验;qRT-PCR和Western blot实验结果表明,与p CDH组和Con组相比,Bin1+组细胞中PD-L1表达水平明显下调(P0.05),而p CDH组和Con组细胞中PD-L1表达水平差异无统计学意义(P0.05),说明Bin1过表达可以抑制H1975细胞中PD-L1的表达水平。2 qRT-PCR和Western blot实验表明,与Con组相比,Bin1-si RNA组H1975细胞中Bin1基因和蛋白表达水平显著下降(P0.05),说明H1975细胞中的Bin1已经成功被敲低。与Con组相比,Bin1-si RNA组细胞中PD-L1水平明显上调(P0.05),说明Bin1可以负向调控PD-L1的表达。3 qRT-PCR和Western blot结果显示,与Con组相比,c-MYC-si RNA组H1975细胞中c-MYC基因和蛋白水平明显下调(P0.05),表明H1975细胞中的c-MYC已经成功被敲低;与Con组相比,c-MYC-si RNA组H1975细胞中PD-L1基因和蛋白水平明显下降(P0.05),说明Bin1可以通过失活c-MYC抑制PD-L1的表达进而抑制NSCLC的免疫逃逸。结论:1在人非小细胞肺癌H1975、H1650、A549、H460和人胚肺成纤维细胞2BS中,H1975细胞中的Bin1基因和蛋白表达水平最低;以慢病毒转染的方法成功建立Bin1稳定过表达的H1975细胞系。2 Bin1能够抑制H1975细胞的增殖、迁移及侵袭能力。3在人非小细胞肺癌H1975、H1650、A549、H460和人胚肺成纤维细胞2BS中,H1975细胞中的PD-L1基因和蛋白表达水平最高;Bin1可以抑制H1975细胞中PD-L1的表达水平,敲低H1975细胞中c-MYC的表达水平可以显著下调H1975细胞中PD-L1的表达水平,说明Bin1可以通过失活c-MYC途径抑制非小细胞肺癌中PD-L1的表达。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

【参考文献】

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1 Yan-yan Chen;Liu-bo Wang;Hui-li Zhu;Xiang-yang Li;Yan-ping Zhu;Yu-lei Yin;Fan-zhen Lü;Zi-li Wang;Jie-ming Qu;;Relationship Between Programmed Death-ligand 1 and Clinicopathological Characteristics in Non-small Cell Lung Cancer Patients[J];Chinese Medical Sciences Journal;2013年03期

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本文编号：2306212