脂肪细胞及脂肪因子调控多发性骨髓瘤细胞增殖和耐药的研究

发布时间：2018-11-02 20:07

【摘要】：第一部血清脂肪因子水平与多发性骨髓瘤疾病的关系目的：肥胖是肿瘤发生的一个危险因素,某些脂肪因子血清水平同肿瘤患病风险有-定的联系,并同肿瘤的发生、侵袭、转移及耐药行为密切相关,本部分通过柃测MM患者血清脂肪因子水平,评估脂肪因子水平在MM中的意义。方法：采用ELISA检测28例新诊断的MM患者血清中脂肪因子(瘦素、脂联素、抵抗素、内脂素)的水平,选取28例性别和年龄匹配的健康的体检者作为对照组。研究这些脂肪因子水平同MM发病的关系；以及同MM疾病分期和MM相关预后指标(如骨髓浆细胞%、132微球蛋白和血沉)、常规生化指标(LDH、ALB、GLB、Ca2-)的相关性。结果：多发性骨髓瘤患者血清瘦素水平明显高于对照组(6.82±3.09ng/ml,2.91+1.81ng/ml, p0.01)且较高疾病分期患者(Ⅲ期)血清瘦素水平明显高于较低疾病分期患者(Ⅰ期和Ⅱ期)；而骨髓瘤患者脂联素水平明显低于对照组(5.79±2.37μ g/ml,9.29±3.45μ g/ml,p0.01),同时较高疾病分期患者(Ⅲ期)血清脂联素水平明显低于较低疾病分期MM患者(Ⅰ期和Ⅱ期)。这提示更低的脂联素水平和更高的瘦素水平同患MM风险相关。在MM患者中,MM患者血清瘦素水平和血清IgG浓度(r=0.607,p=0.001)、骨髓浆细胞比例(r=0.513,p=0.005)、p2微球蛋白(r=0.572,p=0.01),血沉(r=0.374,p=0.05)显著正相关；同白蛋白水平(r=-0.546,p=0.003)显著负相关；而同LDH(r=-0.014,p=0.943),血红蛋白浓度(r=-0.279,p=0.151)、血清钙浓度(r=-0.275,p=0.156)无相关性。MM患者脂联素水平同IgG浓度(r=-0.575,p=0.001)、β2微球蛋白(r=-0.577,p=0.001)、血沉(r=-0.441,p=0.019)显著负相关；同白蛋白水平(r=0.517,p=0.005)显著正相关。而与骨髓MM细胞比例(r=-0.065,p=0.741)=LDH (r=-0.179,p=0.362)、血红蛋白1浓度(r=0.262,p=0.179)、血清钙浓度(r=0.264,p=0.175)无相关性。内脂素和抵抗素同任何一个MM预后指标无相关性。结论：瘦素在多发性骨髓瘤患者中水平升高,脂联素在骨髓瘤患者中水平降低,因此我们推测脂联素在机体中是一个保护因素,而瘦素则增加患上MM的风险。此外血清瘦素水平以及脂联素水平同MM临床指标具有相关性提示脂肪因子可能对多发性骨髓瘤预后评估具有一定的参考意义。第二部分脂肪细胞通过瘦素/瘦素受体调节MM细胞增殖与耐药目的：体外实验探讨脂肪细胞及脂肪细胞分泌的脂肪因子瘦素对多发性骨髓瘤细胞增殖和耐药的影响及相关机制。方法：选取能稳定诱导分化的脂肪细胞系3T3-L1,以油红0的方法对分化的脂肪细胞进行鉴定,用ELISA法检测其上清分泌的瘦素水平,同时取正常人骨髓,从中分离MSCs,将其分化诱导为脂肪细胞,用ELISA方法检测其上清瘦素水平。不同的条件处理细胞：MM细胞单独培养；MM细胞系同3T3-L1脂肪细胞直接接触共培养；MM细胞系同3T3-L1脂肪细胞直接接触共培养同时加入瘦素/OB抗体；CFSE的方法检测MM细胞系增殖情况,PI单标流式细胞学检测MM细胞系细胞周期；脂肪细胞同MM细胞共培养,western blotting检测脂肪细胞对MM细胞细胞周期调节蛋白1cyclinDl及信号通路蛋白AKT及STAT3磷酸化水平的影响。检测脂肪细胞对MM细胞耐药的影响。将细胞不同条件处理：MM细胞单独培养同时加入硼替佐米(或地塞米松)：MM细胞同脂肪细胞直接共培养同时加入硼替佐米(或地塞米松)：采用Annexin V FITC/PI双染法流式细胞术检测脂肪细胞对化疗药物诱导MM细胞凋亡的影响。同时用westernblotting的方法检测脂肪细胞对MM细胞抗凋亡相关蛋白Bcl-2和凋亡蛋白caspase-3表达。结果：1)3T3-L1细胞系能稳定分化为脂肪细胞,分化率在80%-90%左右,将其作为实验用细胞。2)3T3-L1脂肪细胞和人MSCs分化的脂肪细胞均分泌瘦素。3T3-L1脂肪细胞上清瘦素浓度为：0.88±0.17ng/ml, MSCs分化的脂肪细胞上清瘦素浓度为：1.52±0.12ng/ml3) MM细胞系同3T3-L1直接共培养可促进MM细胞系的增殖,其中细胞系U266和NCI-H929的增殖较对照组具有显著差异,后续实验选取这两种细胞系进行研究。4)3T3-L1脂肪细胞同MM细胞共培养时,加入抗瘦素/OB抗体后,脂肪细胞促进MM细胞增殖的效应被抑制。5)3T3-L1脂肪细胞同MM细胞共培养促进细胞周期,同时上调细胞周期蛋白cyclinDl的表达。6)共培养使信号通路AKT和STAT3磷酸化水平升高。加入瘦素/OB抗体时, AKT和STAT3的磷酸化水平下降。7)脂肪细胞与MM细胞共培养,硼替佐米或地塞米松对MM细胞诱导凋亡的作用被削弱,其中硼替佐米诱导凋亡的作用明显被削弱8)加入硼替佐米的情况下,3T3-L1脂肪细胞同MM细胞共培养上调了抗凋亡蛋白Bcl-2,保护MM细胞促凋亡蛋白caspase-3不被活化。结论：脂肪细胞通过瘦素/瘦素受体激活AKT和STAT3信号通路,脂肪细胞同MM细胞共培养上调细胞周期蛋白cyclinDl和抗凋亡蛋白Bcl-2,保护MM细胞促凋亡蛋白caspase-3不被活化从而促进MM细胞增殖,加强MM细胞耐药,最终有助于MM细胞生存和发展。第三部分瘦素激活JAK/STAT-PI3K/AKT途径促进MM细胞增殖目的：研究瘦素促进MM细胞增殖的机制。方法：应用cck8法检测人重组瘦素对MM细胞U266和NIL-H929的影响。以不同浓度人重组瘦素(25ng/ml-200ng/ml)处理MM细胞,不同时间点(12,24,48小时)检测MM细胞增殖。检测瘦素对细胞通路蛋白激活状态。50ng/ml瘦素处理MM细胞,在不同时间点收集细胞,Western blotting检测AKT、STAT3蛋白表达水平及AKT和STAT3磷酸化水平。JAK/STAT化学抑制剂AG490和PI3K化学抑制剂LY294002对瘦素诱导MM细胞增殖的影响及相关细胞通路蛋白的影响。结果：1)人重组瘦素以时间依赖方式促进MM细胞增殖,但不依赖浓度,人重组瘦素在浓度为50ng/ml的浓度下对MM细胞促增殖作用最强,当浓度大于50ng/ml,促增殖作用减弱。2)50ng/ml瘦素升高MM细胞STAT3磷酸化水平,处理后6h磷酸化水平达最高,50ng/ml瘦素升高MM细胞AKT磷酸化水平,处理后1h磷酸化水平达最高。3)LY294002降低了MM细胞AKT磷酸化水平,而对总AKT蛋白水平及STAT3磷酸化水平无影响。AG490处理后,瘦素诱导升高的STAT3磷酸化水平和AKT磷酸化水平均降低,同时加入AG490和瘦素无法升高两者的磷酸化水平。4)AG490和LY294002均可阻断瘦素对MM细胞的增殖作用。结论：人重组瘦素以时间依赖方式促进MM细胞增殖。瘦素可升高MM细胞STAT3磷酸化水平和AKT磷酸化水平而对总STAT3和AKT无影响。表明瘦素通过激活JAK/STAT-PI3K/AKT途径促进MM细胞的增殖。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.3

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