【摘要】：【目的】胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性肿瘤,约占原发性脑肿瘤的60%-70%。胶质瘤生长部位特殊,手术不易全切,且对放疗、化疗均不敏感,故术后复发率高,常规治疗效果不佳;而恶性胶质瘤(如胶质母细胞瘤)预后更差,半数生存期不足一年。快速增殖和广泛迁移侵袭是恶性胶质瘤的重要生物学特征,同时也是多基因、多通路调控异常的结果。葡萄球菌核酸酶结构域包含蛋白1(SND1)是一种进化上较为保守的蛋白,其可作为多通路的协同转录激活因子,并对RNA代谢起重要调节作用。最新研究显示SND1在多种常见恶性肿瘤细胞(如乳腺癌、结肠癌等)中过表达,提示其功能异常活跃可能与肿瘤的发生发展关系密切。但是,胶质瘤细胞中SND1表达水平是否异常,该异常与肿瘤良恶性级别有何关系,由此引发的SND1功能紊乱在胶质瘤发生发展中的作用及其机制如何,目前尚不清楚。本研究采用人胶质瘤组织学标本及胶质母细胞瘤细胞系U87MG及U251对上述问题进行了深入探讨。【方法】1.采用免疫组织化学方法检测147例不同级别胶质瘤组织和20例非肿瘤对照脑组织SND1、RHOA、MMP2及Ki-67抗原的表达水平;结合TCGA数据库数据,分析SND1、RHOA及MMP2表达水平之间的关系;结合临床随访资料,分析SND1、RHOA、MMP2表达水平与患者总体和无症状生存期之间的关系。2.通过慢病毒感染建立稳定沉默SND1的U87MG和U251亚细胞系(SND1-sh)和稳定表达无义序列的对照亚细胞系(scramble),同时用SND1真核表达质粒和空载体分别转染U87MG和U251细胞(SND1组及pSG5组),并以非转染细胞作为空白对照(mock);采用Western blot检测以上各组细胞中SND1的表达水平;采用MTT及克隆形成实验检测各亚细胞系和mock组细胞的增殖活性以及U251和其亚细胞系的克隆形成效率(CFE),采用transwell体外迁移侵袭实验检测各组细胞的迁移侵袭能力,以明确不同SND1表达水平对胶质瘤细胞上述生物学行为的影响。3.利用qRT-PCR及Western blot检测上述各组细胞SND1、RHOA及MMP2mRNA及蛋白表达水平,以明确SND1对RHOA和MMP2表达的调控作用;采用染色质免疫沉淀(ChIP)以及凝胶迁移率实验(EMSA),在U87MG及U251中验证snd1是否通过转录激活调控的方式上调rhoa和mmp2的表达。4.分别采用流式细胞术(fcm)和westernblot检测u87mg及u251细胞系及其snd1-sh和scramble亚细胞系细胞周期分布及关键周期素、周期素依赖激酶及其抑制因子的表达水平,明确敲低snd1对肿瘤细胞细胞周期分布和增殖的影响;分别利用rhoa特异性小干扰rna(rhoa-si)及其对照无义序列(scramble)与snd1真核表达质粒(snd1)及其空载(psg5)共转染u87mg及u251细胞系建立rhoa-si/snd1组、scramble/snd1组、rhoa-si/psg5组及scramble/psg5组,通过mtt检测各组细胞增殖活性,通过westernblot检测各组snd1、rhoa及关键周期素、周期素依赖激酶及其抑制因子的表达水平,以明确snd1促进胶质瘤细胞细胞周期进展及增殖的分子机制。5.分别利用mmp-2特异性小干扰rna(mmp2-si)及其对照无义序列(scramble)与snd1真核表达质粒(snd1)及其空载(psg5)共转染u87mg及u251细胞系建立mmp2-si/snd1组、scramble/snd1组、mmp2/psg5组及scramble/psg5组,通过体外迁移侵袭实验检测各组细胞迁移侵袭能力,通过westernblot检测各组snd1、rhoa、mmp2表达水平。6.利用westernblot检测snd1-sh和scramble亚细胞系及mock组细胞mmp-2、c-jun、磷酸化c-jun(p-c-jun)水平;检测rhoa-si/snd1组、scramble/snd1组、rhoa-si/psg5组和scramble/psg5组细胞迁移侵袭能力及c-jun、p-c-jun和mmp2的水平,以明确snd1促进胶质瘤细胞迁移侵袭的分子机制。【结果】1.免疫组化结果显示,各胶质瘤组snd1、rhoa、mmp2及ki-67阳性标记指数(li%)均明显高于非肿瘤对照脑组织,并均随肿瘤的良恶性级别的升高而升高,各组间差异均有统计学意义(p0.05~0.001)。相关分析显示,snd1li%与ki-67、rhoa及mmp2li%均呈显著性正相关(r=0.959~0.984,p0.001),这与tcga数据分析结果相同。kaplan-meier生存分析证实,snd1、rhoa及mmp2高表达患者的无症状生存时间和总生存时间均低于低表达患者(p0.0001);cox回归分析显示,snd1、rhoa及mmp2过表达均为影响患者生存时间的风险因素,其中snd1li%为患者无症状和总生存时间的独立预测因子。2.westernblot检测结果显示,各snd1-sh亚细胞系的snd1表达水平均低于相应的mock组、psg5组及scramble亚细胞系,证实稳定敲低snd1表达的u87mg及u251亚细胞株及其无义对照序列亚细胞株构建成功,且snd1真核表达质粒瞬时转染可提高转染细胞内snd1的表达水平。3.mtt检测结果显示,从体外培养4~5d起,snd1-sh亚细胞系的增殖活性明显低于mock组和scramble亚细胞系(p0.05~0.01),u251-snd1-sh亚细胞系的cfe亦明显低于各对照(亚)细胞系(p0.001),证实敲低snd1表达可抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖活性。体外迁移侵袭实验结果证实,各snd1-sh亚细胞系的迁移和侵袭细胞数均明显低于相应的scramble亚细胞系及mock和psg5组细胞(p0.05~0.01),而snd1组则明显高于以上各组(p0.05~0.01),证实敲低snd1可有效抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移侵袭,而转染外源性snd1可明显提高肿瘤细胞的迁移侵袭能力。4.qrt-pcr和westernblot结果显示,各snd1-sh亚细胞系snd1、rhoa及mmp2mrna及蛋白的表达水平均明显低于相应的scramble亚细胞系及mock和psg5组细胞(p0.001),而snd1组三种mrna及蛋白的表达水平均明显高于其它组(p0.001),证实敲低/过表达snd1可有效抑制/提高胶质母细胞瘤细胞内源性rhoa及mmp2mrna和蛋白的表达。chip及emsa实验显示snd1可特异性结合于rhoa及mmp2编码基因的启动子区,证实snd1可作为转录共激活因子通过诱导rhoa及mmp2mrna的转录提高其蛋白的表达水平。5.fcm结果显示,snd1-sh亚细胞系g0/g1期细胞比例明显高于mock组及scramble亚细胞系,证实敲低snd1可通过诱导g1期阻滞抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖。westernblot结果显示snd1-sh亚细胞系ccnd1(cyclind1)、ccne1(cycline1)及cdk4表达水平降低,而cdkn1b(p27kip1)水平升高。共转染实验结果显示:rhoa特异性sirna可在不改变细胞内snd1表达水平的条件下模拟敲低snd1对ccnd1、ccne1及cdkn1b表达的影响;过表达snd1可在上调rhoa的同时上调ccnd1、ccne1、cdk4,并下调cdkn1b的表达水平,且该效应可被rhoa特异性sirna完全逆转。以上结果证实,snd1通过诱导rhoa,实现对g1/s转换关键周期素、周期素依赖性激酶及其抑制因子的调控,从而加速细胞周期进展,促进胶质瘤细胞的增殖。6.体外迁移侵袭实验结果显示,mmp2特异性sirna可在不影响snd1及rhoa表达的条件下模拟敲低snd1对胶质母细胞瘤细胞迁移侵袭的影响;过表达snd1可促进胶质母细胞瘤细胞的迁移侵袭,该效应可被mmp2特异性sirna完全逆转。以上结果证实snd1可通过上调mmp2促进胶质瘤细胞的迁移侵袭。7.SND1-sh亚细胞系c-Jun表达水平与相应mock组及scramble亚细胞系无显著差异,但其p-c-Jun水平明显低于后者,证实敲低SND1可抑制c-Jun的磷酸化。共转染实验结果显示:RHOA特异性siRNA可模拟敲低SND1对c-Jun磷酸化的影响并下调MMP-2的表达,抑制胶质母细胞瘤细胞的迁移侵袭;过表达SND1可在上调RHOA表达的同时促进c-Jun的磷酸化和MMP-2表达,并促进胶质母细胞瘤细胞的迁移侵袭,且该效应可被RHOA特异性siRNA逆转。以上结果证实,通过诱导RHOA表达提高RHOA/JNK/c-Jun通路的活性是SND1上调MMP2并促进胶质瘤细胞迁移侵袭的另一重要分子通路。【结论】1.胶质瘤细胞普遍存在SND1、RHOA及MMP2的异常高表达,三者的表达水平随胶质瘤良恶性级别的升高而升高,故其阳性标记指数均可作为评价胶质瘤良恶性级别的辅助指标。胶质瘤细胞SND1、RHOA及MMP2表达水平均与患者生存时间密切相关,其中,SND1表达水平可作为患者预后的独立预测因子。2.在胶质瘤细胞中SND1是RHOA和MMP2表达的重要调控因子,SND1可直接结合于RHOA和MMP2基因的启动子区,并作为转录共激活因子诱导RHOA和MMP2 mRNA的转录,从而提高内源性RHOA和MMP2的表达水平。3.RHOA是SND1调节胶质瘤细胞增殖的重要靶点。SND1可通过上调RHOA提高肿瘤细胞cyclin D1、cyclin E1及CDK4的表达水平,并抑制p27Kip1的表达,从而加速G1/S转换,促进胶质瘤细胞增殖。4.MMP2是SND1调节胶质瘤细胞迁移侵袭的重要靶点。SND1不仅可直接上调MMP2,还可通过激活RHOA/JNK/c-Jun通路诱导MMP2表达,并最终提高胶质瘤细胞的迁移侵袭能力。5.SND1表达异常升高是导致胶质瘤发生、发展的重要原因,亦是胶质瘤细胞获得无限增殖和活跃迁移侵袭能力的重要分子机制。靶向沉默SND1表达可通过抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移侵袭发挥胶质瘤抑瘤作用,有可能成为对恶性胶质瘤进行有效干预的重要策略。此外,敲低RHOA及MMP2亦可发挥明确的胶质瘤抑瘤作用,故亦可作为恶性胶质瘤分子干预的有用靶点。6.本研究采用的慢病毒载体可有效感染胶质瘤细胞并敲低SND1表达,为沉默SND1提供了有效的技术手段。研究过程中建立的稳定敲低SND1的U87MG和U251亚细胞系和对照亚细胞系为进一步研究SND1对胶质瘤生物学行为的影响提供了可靠的细胞模型。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.4
【共引文献】
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本文编号：
2307111
