沉默LIMK1对罗格列酮抑制人胃癌MGC803细胞增殖、迁移与侵袭的影响

发布时间：2018-11-06 09:49

【摘要】：目的:利用慢病毒介导LIMK1沉默的方法,观察罗格列酮(Rosiglitazone,ROS)抑制人胃癌MGC803细胞增殖、迁移与侵袭的作用。方法:设计并构建3条LIMK1沉默的sh RNA载体,包装成慢病毒,根据预试验的转染效率计算MOI值;采用荧光定量PCR(q RT-PCR)和蛋白免疫印记法(western blot)分别在m RNA和蛋白水平上检测LIMK1的沉默情况,选择一条沉默效率最佳的sh RNA-LIMK1用于后续实验;ROS分别处理人胃癌MGC803细胞及LIMK1沉默的MGC803细胞后,在m RNA和蛋白水平上检测LIMK1的表达情况。CCK-8(Cell Counting Kit-8)、平板克隆形成实验、流式细胞术、Transwell小室迁移、侵袭实验观察沉默LIMK1对ROS抑制人胃癌MGC803细胞增殖、迁移与侵袭的影响。结果:1.成功构建了3条LIMK1-sh RNA慢病毒载体并包装成病毒。设计3条LIMK1 sh RNA序列,分别为LV-LIMK1-RNAi(37154-1)、LV-LIMK1-RNAi(37155-1)、LV-LIMK1-RNAi(37156-1)和一条阴性对照序列LV,并包装成慢病毒,通过预实验得到MGC803细胞的MOI值为50。2.成功筛选出最佳LIMK1-RNAi(37156-1)干扰序列。3条sh RNA干扰序列LV-LIMK1-RNAi(37156-1)、(37155-1)、(37154-1)对LIMK1 m RNA的抑制率分别为91.9%、75.9%、90.7%,蛋白抑制的效果分别为72.4%、29.4%、63.7%。其中阴性病毒组与未感染组比较差异无统计学意义(P0.05)。因此,LV-LIMK1-RNAi(37156-1)沉默效果最佳。3.ROS在m RNA和蛋白水平上抑制LIMK1的表达。结果显示:在MGC803细胞中,ROS能够在m RNA和蛋白水平上抑制LIMK1的表达(P0.05);在LIMK1沉默的MGC803细胞中,ROS能够进一步抑制LIMK1的表达(P0.05)。4.LIMK1沉默促进了ROS抑制人胃癌MGC803细胞增殖、迁移与侵袭。4.1 CCK-8实验结果表明:在MGC803细胞中,ROS处理组细胞活力明显低于未处理组(P0.05);在LIMK1沉默的MGC803细胞中,LIMK1的沉默能够降低细胞的增殖能力(P0.05);加入ROS处理后,LIMK1的沉默组细胞活力与未沉默组相比细胞活性有显著减少(P0.05)。4.2平板克隆形成实验结果提示:在MGC803细胞中,ROS处理组集落形成数明显少于未处理组(P0.05);在LIMK1沉默的MGC803细胞中,沉默组集落形成数较未沉默组明显减少(P0.05);加入ROS处理后,LIMK1的沉默组与未沉默组比较细胞集落数有显著性减少(P0.05)。4.3流式细胞仪检测周期结果显示:在MGC803细胞中,ROS处理组细胞周期发生G1期停滞的现象,而相应的S期细胞数量则显著减少(P0.05);在LIMK1沉默的MGC803细胞中,LIMK1沉默组的G1期细胞比例也明显增加(P0.05);加入ROS处理后,LIMK1的沉默组与未沉默组比较G1期细胞比例进一步增加。4.4 Transwell迁移实验显示:在MGC803细胞中,ROS处理组迁移细胞数明显减少(P0.05);在LIMK1沉默的MGC803细胞中,LIMK1沉默组迁移细胞数也明显减少(P0.05);加入ROS处理后,LIMK1的沉默组与未沉默组比较迁移细胞数有显著性减少(P0.05)。4.5 Transwell侵袭实验显示:在MGC803细胞中,ROS处理组穿膜细胞数明显减少(P0.05);在LIMK1沉默的MGC803细胞中,LIMK1沉默组穿膜细胞数也明显减少(P0.05);加入ROS处理后,LIMK1的沉默组与未沉默组比较穿膜细胞数有显著性减少(P0.05)。结论:1.ROS可抑制人胃癌MGC803细胞中LIMK1表达,且LIMK1沉默后ROS对LIMK1抑制更显著。2.沉默LIMK1可促进罗格列酮抑制人胃癌MGC803细胞增殖、迁移与侵袭。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

【参考文献】

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本文编号：2313933