ILT3在非小细胞肺癌中的作用及分子机制探究

发布时间：2018-11-10 07:21

【摘要】：研究背景肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一,其死亡率居恶性肿瘤的第一位,其中80～85%的患者为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。大部分NSCLC病人初次诊断时已处于进展期或已发生转移。因此,探索NSCLC细胞发生侵袭转移的分子机制对于寻找NSCLC的治疗靶点十分必要。肿瘤的侵袭转移是一个多种因素参与、多步骤完成的复杂过程,包括肿瘤细胞获得更强的增殖生存和迁移侵袭能力、免疫逃逸以及肿瘤血管淋巴管生成等多个生物过程。而上述过程的启动和维持依赖于肿瘤细胞和间质中多种多样的细胞因子。近来越来越多的研究发现免疫调节分子在肿瘤细胞中高表达且参与肿瘤的进展转移。免疫球蛋白样转录子(immunoglobulin-like transcript, ILT)是一组免疫球蛋白超家族分子,其基因均定位于人19号染色体。依据功能性质,ILT家族成员被分为刺激性受体(ILT1,ILT6,ILT7和ILT8)和抑制性受体(ILT2,ILT3,ILT4和ILT5),其中抑制性受体的胞内段含免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM),可发挥免疫抑制功能。本课题组之前的研究发现ILT4参与促进NSCLC的进展转移。ILT3亦属于ILT家族抑制性受体中的一员,主要在单核细胞以及树突状细胞(dendritic cells, DCs)等细胞中表达。目前,国内外对ILT3的研究主要集中于该分子对抗原递呈细胞的影响,使其无法激活免疫细胞,并参与移植耐受。但对ILT3在肿瘤细胞中的表达以及它们在肿瘤细胞中表达的作用报道较少。仅有报道ILT3在人慢性淋巴细胞白血病中的恶性B细胞,人胃癌细胞以及母鸡自发性卵巢癌细胞中高表达,且在慢性淋巴细胞白血病中ILT3的表达与淋巴组织浸润相关。此外,可溶性ILT3能够抑制人源化SCID小鼠对同种异体肿瘤的排异,某些癌症病人血清中存在可溶性ILT3,能够诱导CD8+抑制性T细胞的分化和抑制混合淋巴细胞培养中的T细胞反应。我们前期研究发现ILT3在NSCLC组织中高表达,而在正常肺组织中低表达或无表达,且肿瘤细胞中ILT3的表达与癌组织中肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltration lymphocytes, TILs)数量呈显著负相关。ILT3在NSCLC组织中高表达提示其可能在促进NSCLC进展中发挥作用；然而对于ILT3在NSCLC发生进展中的具体作用及其分子机制目前尚未见报道。研究目的为明确ILT3在NSCLC发生进展中的作用,我们通过免疫组化和qPCR检测NSCLC组织样品和癌旁正常肺组织样品中ILT3的表达,并分析其表达与临床病理参数及病人生存预后的相关性；然后通过转染技术,上调或下调NSCLC细胞中ILT3的表达,检测ILT3对NSCLC细胞增殖、抗凋亡和迁移侵袭等恶性生物学行为的影响；并进行下游基因和分子通路的筛选,进一步揭示ILT3发挥生物作用的分子机制,为探索ILT3在NSCLC生物治疗中的潜在价值提供初步理论基础。研究方法1.通过qPCR检测ILT3 mRNA在NSCLC患者新鲜肿瘤组织和配对的癌旁正常肺组织中的表达,统计分析ILT3在NSCLC组织和正常肺组织之间的表达差异。2.通过免疫组织化学染色检测ILT3在NSCLC组织及癌旁正常肺组织中的表达；依据免疫组化染色评分,统计分析肿瘤细胞内ILT3的表达水平与NSCLC患者临床病理参数之间的相关性；收集NSCLC患者的预后随访资料,应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析ILT3的表达与NSCLC患者生存率之间的关系。3.通过qPCR和Western blot检测ILT3在6株NSCLC细胞系中的表达,筛选出高表达和低表达ILT3的细胞系。选择内源性低表达ILT3的细胞系H1650和H1299转染ILT3表达质粒上调ILT3的表达；选择内源性高表达ILT3的细胞系A549和H226转染ILT3 shRNA质粒下调ILT3表达。4.采用MTT生长曲线检测ILT3对NSCLC细胞增殖能力的影响：采用AnnexinV-FITC/PI染色检测ILT3对NSCLC细胞抗凋亡能力的影响；采用Transwell迁移侵袭实验检测ILT3对NSCLC细胞迁移侵袭能力的影响。5.通过慢病毒感染和筛选获得稳定过表达ILT3的NSCLC细胞株ILT3/H1650和对照细胞株pEZ-Lv105/H1650。选用BALB/cNude裸鼠建立尾静脉转移模型,以体内观察ILT3对NSCLC细胞转移能力的影响。6.采用Western blot检测ILT3对MAPK和PI3K-Akt通路相关蛋白表达的影响,筛选出ILT3的下游信号通路；然后通过加入通路抑制剂,观察ILT3过表达细胞在抑制相关信号通路后迁移侵袭能力的变化。7.采用Western blot检测ILT3对上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)指标蛋白的调节作用。8.采用Western blot检测ILT3对血管形成相关分子(VEGF-A、FGF1)的调节作用；并通过加入信号通路抑制剂,筛选ILT3发挥调节作用的关键信号通路。收集过表达ILT3和干扰ILT3表达的NSCLC细胞的培养上清,检测其对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cell, HUVEC)血管形成的影响。9.FGF1是候选肿瘤标记物分子,但目前尚没有关于FGF1在NSCLC中表达的研究。本研究中通过免疫组织化学染色检测FGF1在NSCLC组织中的表达,并分析其表达与病人临床病理参数和生存预后的相关性。研究结果1.ILT3在NSCLC组织中的表达显著高于癌旁正常肺组织且与病人不良预后相关qPCR检测结果示大部分(20/28)NSCLC组织中ILT3mRNA的表达水平显著高于配对的周围正常肺组织；免疫组化结果亦显示ILT3在原发性NSCLC肿瘤细胞中高表达,阳性表达率为66.4%(75/113),且ILT3的表达与原发肿瘤大小(p=0.026)、细胞低分化(p=0.039)、血管浸润(p=0.027)及TNM分期(p=0.018)等临床病理参数呈显著正相关；高表达ILT3组患者的瘤内微血管密度显著高于低表达组；且高表达ILT3组患者的5年生存率显著低于低表达组。2.ILT3促进NSCLC细胞迁移侵袭qPCR和Western blot结果示：ILT3在所检测的6株NSCLC细胞系(A549、H226、H520、H1299、H1650及H1975)中均存在表达,其中H1650、H1299及H1975属低表达细胞系,而A549、H226和H520为高表达细胞系。过表达ILT3后,H1650和H1299细胞的迁移侵袭能力显著增强；干扰ILT3表达后,A549和H226细胞的迁移侵袭能力受到明显抑制；然而,ILT3对NSCLC细胞的增殖和抗凋亡能力无显著影响。3.ILT3促进NSCLC细胞体内转移裸鼠尾静脉注射转移模型的结果显示：过表达ILT3的H1650细胞在裸鼠肺组织形成转移灶的数目较对照组显著增多,提示ILT3可促进NSCLC细胞在体内的转移。4.ILT3通过激活ERK和PI3K-Akt通路促进NSCLC细胞的迁移侵袭Western blot结果显示：上调ILT3表达后,H1650细胞中MAPK和PI3K-Akt通路中的关键蛋白ERK和Akt的磷酸化水平显著升高；而干扰ILT3表达后,A549细胞中ERK和Akt的磷酸化水平明显下降。随后,H1650细胞转染ILT3过表达质粒后再加入ERK通路抑制剂U0126或PI3K-Akt通路抑制剂LY294002处理,细胞的迁移侵袭能力均受到明显抑制。5.ILT3促进NSCLC细胞发生不完全EMTWestern blot结果显示：上调ILT3表达后,H1650细胞中vimentin的表达水平明显升高,而E-cadherin的表达无明显变化；干扰ILT3表达后,A549细胞中vimentin的表达水平显著下调,而E-cadherin的表达亦无明显变化。6.ILT3上调血管生成相关因子VEGF-A和FGF1的表达并增强血管内皮细胞的成管能力。因免疫组化分析结果提示ILT3可促进肿瘤生长转移,且与瘤内微血管密度相关,于是我们检测了ILT3对经典的促血管生成因子VEGF-A和FGF1表达的影响。Western blot结果示：上调ILT3表达后,H1650细胞中VEGF-A和FGF1的表达水平明显升高；而干扰ILT3表达后,A549细胞中VEGF-A和FGF1的表达水平明显降低。在H1650细胞转染ILT3过表达质粒后加入ERK信号通路抑制剂U0126或PI3K-Akt通路抑制剂LY294002,ILT3对VEGF-A和FGF1的上调作用均受到明显抑制。此外我们收集过表达ILT3的H1650细胞和干扰ILT3表达的A549细胞及各自对照细胞的培养上清做为条件培养基培养HUVEC,观察其成管能力和细胞内ERK1/2及PI3K-Akt通路的活化情况。小管形成实验示：H1650细胞过表达ILT3后,其培养上清可增强]IUVEC的成管能力；而干扰ILT3表达的A549细胞的培养上清培养的HUVEC的成管能力减弱。Western blot结果示：过表达ILT3的H1650细胞的条件培养基培养的HUVEC内ERKI/2和Akt的磷酸化水平显著高于对照组,而干扰ILT3表达的A549细胞的条件培养基培养的HUVEC内pERK和pAkt的水平明显低于对照组。7.FGF1在NSCLC组织中表达的临床病理意义FGF1在NSCLC组织中高表达,且其表达水平与原发肿瘤大小、组织学类型和血管浸润相关。肺鳞癌中FGF1的表达水平显著高于肺腺癌,在鳞癌和腺癌亚组内FGF1的表达与微血管密度呈正相关。在肺鳞癌亚组内,FGF1高表达与预后不良相关,但在肺腺癌亚组内FGF1高表达与预后生存无显著相关性。结论1.ILT3在人NSCLC组织内高表达,且肿瘤细胞内ILT3的表达与NSCLC病人预后不良相关,可用于判断预后。体外和体内实验证实ILT3可促进NSCLC细胞的迁移侵袭能力。2.ILT3可通过ERK和PI3K-Akt信号通路上调血管生成相关因子VEGF-A和FGF1的表达,并促进血管内皮细胞的小管形成能力。3.FGF1在NSCLC组织中高表达,且肺鳞癌中FGF1的表达水平显著高于肺腺癌,在肺鳞癌亚组内FGF1高表达与预后不良相关。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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