【摘要】：肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是恶性肿瘤中最常见的一类,死亡率高,缺乏有效的治疗手段。肝癌可由多因素导致,并呈渐进性、多阶段发展,但其发病机制尚不清楚。文献报道[5,6],肝癌的产生不仅与遗传相关,也同样受到表观遗传修饰的影响。通过表观遗传学(Epigenetics)的研究可为进一步阐明肝癌发病机制,寻找药物作用靶点,研发治疗肝癌的药物开辟新的领域和新的途径。表观遗传学研究内容包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控等。蜂毒素是从蜂毒中提取出来的肽类物质,具有杀菌、抗炎和镇痛和抗肿瘤作用等。本研究以HepG2和SMMC-7721细胞为实验对象,在明确蜂毒素抑制肝癌细胞增殖作用的基础上,观察了蜂毒素对MeCP2表达的调控及对Shh信号通路的影响,并探讨蜂毒素对HDAC2表达的影响以及非编码RNA MALAT1基因和microRNA Mir-203在其中发挥的作用,旨在阐明蜂毒素对肝癌细胞中多种表观遗传学修饰的影响,为肝癌的研究与防治提供新的思路。具体研究内容包括以下五个部分：1、蜂毒素对肝癌细胞的增殖抑制作用采用MTT法检测蜂毒素对肝癌细胞的增殖抑制作用,结果表明,蜂毒素(1、2和4μg/mL)可剂量依赖性抑制SMMC-7721细胞的增殖,可能不干扰SMMC-7721细胞的凋亡,但可提高SMMC-7721细胞G0/G1期百分比。Western blot结果显示,蜂毒素(1、2和4 μg/mL)处理后SMMC-7721细胞cyclin D1和CDK4蛋白表达显著降低。以上实验结果提示,蜂毒素对肝癌细胞株SMMC-7721增殖的抑制作用与其阻滞SMMC-7721细胞周期有关。2、蜂毒素对MECP2表达的调控及对SHH信号通路的影响MTT、实时定量PCR和Western blot结果发现,MeCP2沉默能抑制细胞增殖,而MeCP2过表达促进细胞生长。采用实时定量PCR和Western blot法检测蜂毒素对SMMC-7721细胞MECP2表达的影响,结果发现,蜂毒素(1、2和4μg/mL)以浓度依赖性方式降低SMMC-7721细胞MeCP2的mRNA和蛋白表达。通过转染siRNA-MeCP2和MeCP2质粒发现,MECP2可能有助于蜂毒素对肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用。采用实时定量PCR和Western blot检测蜂毒素及MeCP2对SMMC-7721细胞SHH信号通路的影响,结果发现,MeCP2能调节SHH信号通路,而蜂毒素能诱导PTCH1表达增高,而Shh和GLI1表达明显降低。蜂毒素能显著增加在转染MeCP2质粒的SMMC-7721细胞中已降低的PTCH1表达,Shh和GLI1过表达明显被抑制。以上实验结果提示,蜂毒素在SMMC-7721细胞中通过下调MeCP2抑制SHH信号通路,从而抑制SMMC-7721细胞增殖。3、蜂毒素对HepG2细胞HDAC2表达的调控采用MTT法、Hoechst染色、FCM检测,结果表明蜂毒素可剂量依赖性抑制HepG2细胞的增殖,诱导细胞凋亡。采用实时定量PCR及Western blot检测HDAC2 mRNA和蛋白的表达,结果显示,与空白对照组比较,蜂毒素(1、2和4μg/mL)处理后HepG2细胞HDAC2 mRNA和蛋白表达明显降低,且与给药浓度成负相关。4、沉默长链非编码长链RNA MALAT1对蜂毒素诱导HepG2细胞凋亡的影响采用实时定量PCR法检测蜂毒素对HepG2细胞中MALAT1表达的影响,结果发现,蜂毒素(1、4和8μg/mL)可显著抑制HepG2细胞MALAT1 mRNA的表达。进一步采用MALAT1特异性siRNAs沉默HepG2细胞中的MALAT1,通过MTT法和FCM法观察MALAT1沉默后对蜂毒素诱导的HepG2细胞凋亡的影响,结果发现,沉默MALAT1能有效促进蜂毒素对HepG2细胞增殖抑制和诱导细胞凋亡。以上实验结果提示,蜂毒素可下调HepG2细胞株中MALAT1的表达,沉默MALAT1能有效促进蜂毒素对HepG2细胞增殖抑制和诱导细胞凋亡。5、蜂毒素对非编码微小RNA MiR-203表达及PI3K/AKT信号通路的影响采用实时定量PCR、Western blot等检测蜂毒素对MiR-203表达的影响以及对PI3K/AKT信号通路的影响,进一步研究过表达Mir-203对P13K蛋白表达及PI3K/AKT信号通路的的影响。结果发现,蜂毒素(1、2和4 μg/mL)可上调SMMC-7721和HepG2细胞中Mir-203的表达,下降P13K和P-AKT蛋白的表达,但对编码P13K蛋白的基因PIK3CA mRNA的表达无显著影响。过表达Mir-203能在转录后水平靶向抑制P13K蛋白的表达并抑制PI3K/AKT信号通路的活化。以上实验结果提示,蜂毒素上调Mir-203,在转录后水平抑制PIK3CA基因的表达,抑制PI3K/AKT信号通路的活化。综上所述,蜂毒素对肝癌细胞增殖的抑制作用是多靶点、多途径的综合性效应,可能涉及多种表观遗传修饰途径,包括DNA甲基化修饰、组蛋白翻译后修饰、非编码RNA等。本研究结果表明表观遗传学修饰在蜂毒素抗肿瘤效应中发挥重要作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
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