UBE2T促进前列腺癌细胞上皮间质转化及侵袭转移的作用机制研究

发布时间：2018-11-14 12:56

【摘要】：前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内高居男性癌症致死原因的前列。虽然在我国前列腺癌的发病率低于西方欧美国家,但随着经济水平的提高,人们生活方式的改变及生活水平的提高,前列腺癌的发病率逐年迅速上升,年平均增长率高达12.1%,而大城市更是成为重灾区。目前对前列腺的治疗主要以手术为主,辅以放射性治疗及化疗。如若早期诊断前列腺癌并进行综合治疗,手术效果显著,病人预后较好,但是因为前列腺癌起病隐匿,容易被忽视,大多数前列腺癌患者是在被确诊时已经发生转移,而转移及随后而来的并发症成为前列腺癌患者的主要死亡原因。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)和间质上皮转化(mesenchymal epithelial 1 transformation, MET)被认为是癌症细胞转移的起始或者终止阶段中的关键步骤。在上皮间质转化过程中,癌症细胞由上皮形态向间质细胞形态转化,细胞间黏附能力减弱,细胞运动能力增强,细胞获得自由改变形态的能力。基于此,前列腺癌细胞在上皮间质转化后获得更强的运动和侵袭能力,这使得他们能够穿过细胞基底膜、血管内膜进而进入循环系统,在其他部位发生间质上皮转化而形成新的转移灶。上述便是前列腺癌转移过程中的关键步骤。因此寻找与EMT或者MET相关的基因成为当下前列腺癌研究的热点。泛素蛋白酶体途径是蛋白降解的主要途径,在此过程中,泛素(76个氨基酸组成的多肽)在ATP的作用下被泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme, E1)转移至泛素偶联酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2),再由泛素连接酶(ubiquitin ligase, E3)转移至底物蛋白上。当底物蛋白结合一个或者多个泛素后会被蛋白酶体识别进而被降解为多肽。E2在蛋白泛素化降解过程中起着承前启后的作用,UBE2T (ubiquitin-conjugating enzyme 2T)是近期发现的E2家族的一员。目前,关于UBE2T的研究主要集中在起在DNA损伤修复途径中的作用,主要是UBE2T参与FA通路(Fanconi anemia pathway)过程中FANCD2的泛素化,从而激活DNA损伤修复过程。也有研究证明UBE2T在乳腺癌中作为潜在的癌基因能够抑制乳腺癌抑癌基因BRCA1/BRCA2的表达,从而促进乳腺癌的增殖转移。然而UBE2T在肿瘤中的作用少见报道,其作用机制尚不明确,因此进步研究UBE2T在肿瘤的作用及机制是未来UBE2T研究的重点。本研究主要探讨UBE2T在前列腺癌中促进前列腺癌细胞增殖、转移的作用,并深入探讨其分子机制。该研究不仅补充了UBE2T在肿瘤中的生物学功能,还进一步完善了其作用机制。同时,也为临床前列腺癌的诊断和治疗提供新的可能靶点。第一部分E2泛素偶联酶UBE2T与前列腺和乳腺肿瘤转移的相关性究[目的]应用前列腺癌、乳腺癌组织芯片研究UBE2T在不同临床病理分级的前列腺癌和乳腺癌组织中的表达差异,分析UBE2T与前列腺癌、乳腺癌转移的相关性,为进一步研究UBE2T在肿瘤转移中的作用打下基础。[方法]1·运用西安艾莉娜生物科技有限公司的前列腺癌组织芯片PR483a,采用免疫组织化学法检测UBE2T在正常前列腺组织、原位前列腺癌组织和已发生转移的原位前列腺癌组织中的表达变化。2·运用西安艾莉娜生物科技有限公司的乳腺癌组织芯片BR1321,采用免疫组织化学法检测UBE2T在正常前列腺组织,原位前列腺癌组织和已发生转移的原位前列腺癌组织中的表达变化。[结果]1.采用免疫组织化学法检测前列腺癌组织芯片中UBE2T的蛋白表达水平,结果表明正常前列腺中UBE2T表达最低,原位前列腺癌中表达较高,而已发生远处转移的原位前列腺癌中UBE2T的表达最为显著。2.采用免疫组织化学法检测前列乳癌组织芯片中UBE2T的蛋白表达水平,结果表明正常乳腺中UBE2T表达最低,原位乳腺癌中表达较高,而已发生远处转移的原位乳腺癌中UBE2T的表达最为显著。3. UBE2T过表达的前列腺癌患者预后生存率明显降低。[结论]1.前列腺癌和乳腺癌组织芯片的免疫组化结果证实UBE2T在已发生远处转移的原位肿瘤组织中表达最为显著,在原位肿瘤组织中表达低于前者,正常组织中表达最低。这表明UBE2T与肿瘤细胞的侵袭转移有着密切的相关性。第二部分UBE2T促进前列腺癌细胞增殖、EMT及侵袭转移[目的]第一部分结果提示UBE2T表达可能与前列腺癌细胞侵袭转移有关,我们希望通过相应的体外细胞实验及裸鼠成瘤、转移模型来验证UBE2T是否促进前列腺癌细胞的增殖及侵袭转移。[方法]1.采用UBE2T基因过表达质粒pBabe-UBE2T及其对照空白质粒,通过逆转录病毒转染的方法在前列腺癌细胞系Du145和PC3构建UBE2T过表达细胞系及对照细胞系：Dul45-pBabe-UBE2T, Du145-pBabe, PC3-pBabe-UBE2T, PC3-pBabe。上述细胞系经2ng/mL嘌呤霉素筛选后,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测UBE2T的表达改变。2.采用两个UBE2T基因沉默质粒pSuper-shUBE2T.A和pSuper-shUBE2T.D及对照空白质粒,通过逆转录病毒转染的方法在前列腺癌细胞系Du145和PC3构建UBE2T沉默细胞系及对照细胞系：Du145-pSuper-shUBE2T.A, Du145-pSuper-shUBE2T.D, Du145-pSuper, PC3-pSuper-shUBE2T.D PC3-pSuper。转染的细胞系经2ng/mL嘌呤霉素筛选后,RT-PCR:和Western blot检测UBE2T的表达改变。3.应用上述构建的UBE2T过表达或沉默的细胞系,通过MTT和克隆形成检测UBE2T对肿瘤细胞增殖能力的影响。4.应用上述构建的UBE2T过表达细胞系,显微镜下观察UBE2T对细胞形态的影响,通过western blot,免疫荧光和免疫组化等方法检测UBE2T对EMT标志蛋白(E-cadherin, Vimentin, Fibronectin, alpha-smooth muscle acting)表达的影响。5.应用上述构建的UBE2T过表达细胞系,通过划痕实验,Transwell小室迁移实验检测UBE2T对前列腺癌细胞运动能力的影响；Matrigel侵袭实验检测UBE2T对前列腺癌细胞侵袭能力的影响。6.应用稳定过表达UBE2T的前列腺癌细胞系及其空白对照细胞系,通过皮下注射和尾静脉注射的方式,建立裸鼠肿瘤生成模型和裸鼠远处转移模型,检测UBE2T对肿瘤生长及远处转移的影响。7.应用UBE2T沉默的前列腺癌细胞系及其空白对照细胞系,通过皮下注射和尾静脉注射的方式,建立裸鼠肿瘤生成模型和裸鼠远处转移模型,检测UBE2T对肿瘤生长及远处转移的影响。8.采用免疫组化的方法,检测瘤体和转移灶中UBE2T的表达。[结果]1.成功构建UBE2T过表达前列腺癌细胞系及空白对照细胞系：Du145-pBabe-UBE2T, Du145-pBabe, PC3-pBabe-UBE2T, PC3-pBabe。2.成功构建UBE2T沉默前列腺啊细胞系及空白对照细胞系：Du145-pSuper-shUBE2T.A, Du145-pSuper-shUBE2T.D, Du145-pSuper, PC3-pSuper-shUBE2T.D, PC3-pSuper。3.过表达UBE2T促进前列腺癌细胞的增殖,同时沉默UBE2T能够抑制前列腺癌细胞的生长速度。4. UBE2T促使前列腺癌细胞由上皮细胞形态向间质细胞形态变化。5.过表达UBE2T能够促进前列腺癌细胞间质分子标志物(Vimentin, Fibronectin, alpha-SMA)的表达,抑制上皮分子标志物(E-cadherin)的表达。6. UBE2T能够促进前列腺癌细胞体外迁移和侵袭转移能力。7.裸鼠成瘤实验证明UBE2T促进前列腺肿瘤的生长。8.裸鼠转移模型实验表明UBE2T能够促进前列腺癌细胞的体内侵袭转移能力。[结论]1. UBE2T能够促进前列腺癌细胞的增殖。2. UBE2T具有调控前列腺癌细胞EMT及体外迁移、侵袭转移的能力。3. UBE2T能够促进前列腺癌细胞体内增殖和侵袭转移。第三部分UBE2T促进前列腺癌细胞EMT及侵袭转移的分子机制究[目的]体外实验证明UBE2T能够促进前列腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭转移,但是其作用机制尚不明确,该部分目的在于通过一系列实验探讨UBE2T可能的分子机制。[方法]1.串联亲和质谱分析(Tandem affinity purification and Mass Spectrometry, TAP-MS)检测可能与UBE2T相结合的蛋白。2.利用前列腺癌组织芯片检测UBE2T与靶蛋白Vimentin之间的相关性。3.通过western blot实验,检测在放线菌酮(CHX)作用下UBE2T对Vimentin蛋白半衰期的影响4.利用上述方法检测另一靶向Vimentin的分子FBXW7对Vimentin半衰期的影响。5.通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP实验,分析UBE2T, FBXW7和Vimentin三者之间的相互作用。6.通过western blot实验,验证UBE2T和FBXW7是否共同影响Vimentin的蛋白水平。7.通过Co-IP检测UBE2T能够影响FBXW7和Vimentin之间的结合及FBXW7对Vimentin的降解。8.通过系列点突变、Co-IP等试验,分析UBE2T第95位氨基酸是否是UBE2T与Vimentin的结合位点。9.将UBE2T第95位氨基酸突变成同性质的其他氨基酸,检测突变后的UBE2T对前列腺啊细胞增殖,迁移及侵袭转移的影响。[结果]1. TAP-MS、蛋白半衰期等试验结果发现Vimentin是UBE2T可能的靶蛋白之一。2.组织芯片结果表明在前列腺癌组织中UBE2T的表达水平与Vimentin的表达正相关。3. UBE2T能够延缓Vimentin的降解,而FBXW7能够促进Vimentin的降解。4. UBE2T能够抑制FBXW7所引起的Vimentin的降解。5. UBE2T能够影响FBXW7与Vimentin之间的结合,从而影响Vimentin的表达。6. UBE2T第95位的氨基酸是UBE2T与Vimentin的结合位点。7. UBE2T第95位氨基酸突变能够抑制UBE2T促进前列腺癌细胞增殖,迁移及侵袭转移的作用。[结论]1. Vimentin是UBE2T的靶蛋白,UBE2T能够延缓Vimentin的降解。2. UBE2T影响Vimentin的降解通过抑制FBXW7与Vimentin之间的结合实现。3. UBE2T第95位的氨基酸是UBE2T与Vimentin的结合位点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.25

【共引文献】