【摘要】：第一部分HSP90抑制剂在TALL中靶向NOTCH1的机制和功能研究目的：急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是一种常见的儿童癌症,严重威胁未成年人群的生命和健康。其中,T细胞ALL (T-ALL)的治疗仍旧比较困难,尚无靶向药物。NOTCH1是T-ALL病理过程中的重要癌基因,抑制NOTCH1可抑制T-ALL细胞增殖。然而,现有的NOTCH1阻断剂(γ-分泌酶抑制剂)产生明显的耐药性和不良反应,进一步研发替代的NOTCH 1靶向治疗策略对T-ALL的有效治疗至关重要。本研究旨在阐明HSP90抑制剂阻断NOTCH1信号通路的分子机制,并在体内外评价药物对T-ALL的抑制作用,为HSP90抑制剂用于治疗T-ALL提供依据。方法：采用免疫印迹(Western blot)及荧光定量PCR (Real-Time PCR)的方法检测HSP90抑制剂对NOTCH 1蛋白水平及下游靶基因表达的影响：利用蛋白质免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)确定HSP90与NOTCH1的相互作用及HSP90抑制剂诱导NOTCH1的泛素化进程;细胞生长计数及凋亡检测评价HSP90抑制剂对多种T-ALL细胞生长及凋亡的影响：继而利用小鼠异源移植(xenograft) T-ALL模型考察HSP90抑制剂体内抗白血病的疗效。结果：我们发现HSP90抑制剂在多种T-ALL细胞中明显抑制NOTCH1的激活形式ICN1 (intracellular NOTCH1),同时下调Hes1、c-Myc等经典的NOTCH1下游靶基因表达;进一步试验证实HSP90与ICN1直接相互结合,并定位其结合位点为ICN1的PEST结构域;此外HSP90抑制剂能够促进ICN1泛素化,迅速降解这一癌基因蛋白；体外实验显示HSP90抑制剂阻遏多种T-ALL细胞生长增殖并促进凋亡,而且药物在体内可以有效缓解T-ALL模式小鼠的脾脏肿大现象(p0.0001)及骨髓(p0.01)、脾脏(p0.0001)的白血病细胞比例。结论：我们的数据证实NOTCH1是HSP90的新靶点,抑制HSP90的活性可以促进NOTCH1泛素化和降解,提示了NOTCH1蛋白稳态调控的新机制。同时临床前的研究结果也为HSP90抑制剂用于急性淋巴细胞白血病的治疗提供了重要研究基础。第二部分多壁碳纳米管抑制caco-2细胞表面Pgp和MRP4外排功能的机制研究目的：肿瘤细胞膜表面主动外排转运蛋白过表达是引起肿瘤多药耐药的重要机制之一。其中ABC转运体家族蛋白作为经典的外排蛋白,高表达于癌细胞膜表面可以促进化疗药物外排,减少其在细胞内的蓄积,引起癌细胞耐药。课题前期研究发现多壁碳纳米管(MWCNTs)可以抑制ABC家族蛋白重要成员P-糖蛋白(Pgp)及多药耐药相关蛋白4(MRP4)的转运活性,但是机制尚不清楚,因此本课题旨在探讨MWCNTs引起Pgp和MRP4外排功能降低的分子机制,从而为以MWCNTs为载体的抗肿瘤多药耐药转运系统的建立提供科学依据。方法：研究通过流式细胞术(FACS)分析caco-2细胞对Pgp底物罗丹明123(R123)及MRP4底物荧光素(fluorescein)的摄取和外排,以此表征MWCNTs作用对Pgp和MRP4的外排功能的影响；实时荧光定量PCR (Real-time qPCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)方法分析MWCNTs处理对caco-2细胞Pgp及MRP4转录及蛋白翻译的影响;采用免疫荧光标记(Immunofluorescent labling)与流式细胞术相结合的方法检测MWCNTs对caco-2细胞膜表面Pgp及MRP4膜分布的影响；通过扫描电子显微镜及透射电子显微镜观察MWCNTs与caco-2细胞膜的相互作用及其在细胞内的定位。采用逆转录病毒转染的方法探讨Pgp及MRP4的上游调控因子c-Myc发挥的介导作用。结果：研究发现1)MWCNTs抑制P-gp和MRP4的蛋白转运活性；2)MWCNTs抑制P-gp和MRP4的转录、翻译及膜分布：3)MWCNTs同时抑制c-Myc的转录及翻译;4)过表达c-Myc可以挽救MWCNTs对P-gp和MRP4基因表达的抑制;5)MWCNTs与caco-2细胞膜相互作用并能进入细胞定位于胞内囊泡状结构中;6)MWCNTs可以增加caco-2细胞内ROS的产生并引起细胞膜脂质过氧化损伤；7)抗氧化物质不能抵抗MWCNTs对P-gp和MRP4的抑制作用。结论：结果提示MWCNTs可以抑制caco-2内Pgp及MRP4的基因表达；MWCNTs通过抑制癌基因c-Myc的表达来阻遏Pgp和MRP4的基因转录、翻译,进而抑制其外排转运功能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.71
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