过表达hARD1对人大肠癌SW620细胞凋亡影响的研究

发布时间：2018-11-18 22:22

【摘要】：目的:人停滞缺陷蛋白1(human arrest defective 1,hARD1)是一种N-乙酰基转移酶(N-acetyltransferase,NAT),在体内催化多种蛋白质乙酰化;经研究,hARD1与包括大肠癌在内的多种肿瘤密切相关,成为近年来肿瘤诊治的新思路及研究热点之一。本实验通过用过表达重组质粒pCMV6-Entry-ARD1转染人大肠腺癌细胞株SW620,建立hARD1稳定过表达的大肠腺癌细胞系,观察大肠腺癌细胞的增殖、凋亡变化情况,并测定细胞凋亡相关因子mRNA表达水平及蛋白质表达水平,通过对比探讨hARD1过表达后对大肠癌细胞凋亡因子的影响。方法:1.大肠癌SW620细胞株的复苏与培养;2.通过脂质体介导的转染技术和G418细胞筛选法,将重组质粒pCMV6-Entry-ARD1导入SW620大肠癌细胞株,构建hARD1过表达的稳定细胞系并通过QPCR及Western blot检测转染情况;同法将空载质粒导入SW620大肠癌细胞株,构建阴性对照组。3.采用流式细胞术对实验组、空白对照组及阴性对照组进行细胞周期的检验;4.Annexin/PI染色检测三组细胞凋亡情况;5.EDU法检测实验组、空白对照组及阴性对照组三组细胞增殖情况;6.应用Q-PCR、Western blot法检测三组细胞中TNF-α、Fas、caspase-8及BcL-2在mRNA水平与蛋白质水平的表达情况;结果:1.SW620大肠癌细胞复苏和培养成功且生长良好;2.经G418试剂成功筛选出hARD1稳定过表达的大肠癌细胞系;经Q-PCR检测实验组、空白对照组及阴性对照组三组细胞ARD1相对表达量分别为:4.23±0.11、0.82±0.04及1 ±0.04,经方差分析实验组ARD1表达上升和阴性对照组及空白对照组比较(P0.05)差异有统计学意义,阴性对照组和空白对照组比较(P0.05)差异无统计学意义。说明ARD1在实验组中mRNA水平高表达;Western blot检测三组细胞ARD1蛋白质水平表达量提示:实验组1.60±0.02,阴性对照组0.81 ±0.02,空白对照组1 ±0.02,数据经方差分析实验组ARD1表达上升和阴性对照组及空白对照组比较(P0.05)差异有统计学意义,阴性对照组和空白对照组比较(P0.05)差异无统计学意义,说明ARD1在实验组中蛋白水平表达增高;经上述检测表明hARD1过表达细胞系构建成功。3.细胞周期检测提示:G0/G1期细胞:空白对照组占53.0%,实验组占51.8%,阴性对照组占52.4%;S期细胞:空白对照组占17.3%,实验组占13.0%,阴性对照组占16.4%;G2/M期细胞:空白对照组占18.0%,实验组占20.1%,阴性对照组占18.9%;三组细胞的细胞周期经卡方检验差异无统计学意义(P0.05)。4.细胞凋亡检测提示:实验组细胞凋亡水平为1.9%,空白对照组细胞凋亡水平为8.8%,阴性对照组细胞凋亡水平为8.6%。实验组分别与另外两组数据进行比较(P0.05)差异学有统计学意义,空白组与阴性对照组比较(P0.05)差异无统计学意义,说明实验组细胞凋亡率下降有意义。5.EDU检测提示:实验组细胞增殖水平为41%,空白对照组细胞增殖水平为28.3%,阴性对照组细胞增殖水平为25%,对三组细胞增殖水平检测进行卡方检验,实验组增殖升高和阴性对照组及空白组比较(P0.05)差异有统计学意义,阴性对照组和空白组比较(P0.05)差异无统计学意义。6.凋亡途径相关因子mRNA表达水平检测提示:TNF-α表达水平下降,实验组和空白对照组及阴性组比较(P0.05)差异有统计学意义,空白对照组和阴性对照组比较(P0.05)差异无统计学意义;Fas、caspase-8、BCL-2在三组细胞间的表达水平经分析差异无统计学意义(P0.05)。蛋白质表达水平检测提示:Fas在三组细胞间的表达水平经分析差异无统计学意义(P0.05),TNF-α、caspase-8表达下降,实验组和空白对照组及阴性组比较(P0.05)差异有统计学意义,空白对照组和阴性对照组比较(P0.05)差异无统计学意义;BCL-2表达上调,实验组和空白对照组及阴性组比较差异有统计学意义(P0.05),空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:1.本实验表明人大肠癌SW620细胞过表达hARD1后大肠癌细胞凋亡减少、增殖增多、细胞周期无明显变化;说明hARD1可以降低大肠癌细胞凋亡和促进大肠癌细胞的增殖。2.人大肠癌SW620细胞过表达hARD1后凋亡因子TNF-α在mRNA水平和蛋白水平表达下降、caspase-8在蛋白水平表达下降、BcL-2在蛋白水平表达上升;说明hARD 1可能通过促进或抑制多个凋亡因子的表达而抑制大肠癌细胞的凋亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.34

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本文编号：2341454