NONMMUT045874促进肝癌Hca-P细胞体外转移能力并受mmu-miR-330-3p靶向负调控

发布时间：2018-11-19 19:47

【摘要】：背景:肝癌是高致死率肿瘤,常伴有肝内或肝外转移,并且预后较差,复发率高,较难治愈。Hca-P是小鼠肝癌细胞,并具有低(约25%)淋巴结转移率,是肝癌淋巴道起始转移研究的理想细胞模型。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)指的是一类长度超过200 bp、不能编码或具有极弱编码能力的一类RNA。lnc RNA能够影响基因转录、蛋白质修饰等过程,还能影响癌症的预后及耐药性。lnc RNA能够与mi RNA结合,调节其作用靶点,改变生理过程。本课题组前期通过基因芯片发现NONMMUT045874在Hca-P细胞中的表达是其在与Hca-P细胞具有相同的遗传背景、但淋巴结转移率约为75%的Hca-F细胞中的49.3%,这提示我们NONMMUT045874可能与肝癌淋巴道转移相关,但目前还未见相关报道。本课题组在肾癌实体组织及白血病骨髓单个核细胞样本中检测了长链非编码RNA NONHSAT021545(其序列包含NONMMUT045874和mmu-mi R-330-3p潜在结合位点),发现其与has-mi R-330-3p的表达量呈现负相关。本研究通过上调NONMMUT045874表达水平,研究其对Hca-P细胞体外迁移、侵袭能力的影响,并探究其与mmu-mi R-330-3p的内在联系。目的:1.瞬时转染pc DNA3.1-NONMMUT045874质粒至Hca-P,q RT-PCR法检测NONMMUT045874的表达水平;2.探究NONMMUT045874过表达对Hca-P体外增殖、迁移和侵袭能力的影响;3.探究NONMMUT045874表达水平变化对Hca-P的EMT行为的影响;4.研究NONMMUT045874与mmu-mi R-330-3p之间的靶向调控作用,为深入研究肝癌淋巴道转移奠定基础。方法:1.根据NONMMUT045874全长序列以及pc DNA3.1/V5-His B表达载体多克隆位点区设计引物对并扩增全长;2.PCR产物纯化后与p EASY-blunt simple克隆载体连接,获得p EASY-blunt simple-NONMMUT045874克隆质粒;3.将克隆质粒、pc DNA3.1/V5-His B空质粒分别进行双酶切,纯化后连接,获得pc DNA3.1/V5-His B-NONMMUT045874表达质粒;4.使用LipofectamineTM2000将pc DNA3.1-NONMMUT045874以及pc DNA 3.1空载体转染至Hca-P,转染48小时后,q RT-PCR法检测NONMMUT045874过表达水平;5.Transwell小室法检测NONMMUT045874过表达对Hca-P体外迁移及侵袭能力的影响;6.台盼蓝计数法检测NONMMUT045874过表达对Hca-P体外增殖能力的影响;7.q RT-PCR法检测NONMMUT045874过表达对Hca-P的EMT行为的影响;8.分别构建NONMMUT045874与mmu-mi R-330-3p结合位点野生型与突变型双荧光素表达质粒,转染至Hca-P,检测荧光素酶活力的变化;9.Transwell法检测mmu-mi R-330-3p与NONMMUT045874之间的关系。结果:1.构建了pEASY-blunt simple-NONMMUT045874克隆质粒和pc DNA3.1/V5-His B-NONMMUT045874表达质粒;2.q RT-PCR结果表明,与pc DNA3.1组细胞相比,在pc DNA3.1-NONMMUT045874组细胞的NONMMUT045874表达水平上升了4323倍(p=0.0004);3.与对照组相比,NONMMUT045874过表达使Hca-P体外迁移能力增加了120.0%(p=0.0119),侵袭能力提升了78.9%(p=0.0012);4.与对照组相比,NONMMUT045874过表达使Hca-P细胞中Twist1和Twist 2的表达水平分别升高了1110%(p=0.00007)和100%(p=0.007),E-cadherin表达水平降低了39%(p=0.027);5.NONMMUT045874和mmu-mi R-330-3p二者靶向结合,mmu-mi R-330-3p靶向负调控NONMMUT045874对Hca-P细胞体外转移能力的促进。结论:1.pc DNA3.1/V5-His B-NONMMUT045874表达质粒使NONMMUT045874在Hca-P中过表达;2.NONMMUT045874过表达增强Hca-P细胞体外迁移和侵袭能力,不影响Hca-P增殖;3.NONMMUT045874过表达引起Twist1和Twist2表达水平升高,E-cadherin表达水平降低,促进Hca-P体外转移能力;4.mmu-mi R-330-3p靶向负调控NONMMUT045874对肝癌Hca-P细胞体外转移能力的促进作用。
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【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【参考文献】

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