棉酚对人食管癌细胞系SEG-1细胞体外增殖抑制作用和机制及其在裸鼠模型体内作用的实验研究

发布时间：2018-11-20 07:30

【摘要】：研究背景：食管癌是目前最常见的且对人类生命健康构成严重威胁的恶性肿瘤之一。据WHO报道,2012年全世界范围内食管癌新发病例约为45万例,死亡病例约40万例,且全球发病率最高的地区之一为亚洲东部。由此可见我国为食管癌高发地区。据最新的恶性肿瘤流行病学报告显示,2012年我国大陆食管癌新发病例28.7万例/年,在各类恶性肿瘤中排第五位；死亡病例21.1万例/年,死亡率为15.58/10万,在各类恶性肿瘤中排第四位,且与2011年水平基本持平。近年来尽管对食管癌的治疗已经充分引起研究者的重视,而且其诊断、治疗等技术得到了不断的进步,但是由于部分食管癌患者存在早期转移等原因,治疗效果欠佳。常需手术治疗结合化学药物治疗来改善患者预后。因此寻找有效、安全可靠的靶点药物成为目前食管癌化学治疗的热点之一。棉酚作为一种植物化学物,在植物中天然存在且具有抗癌等作用。已有大量研究证实,棉酚可以抑制多种肿瘤细胞系细胞的增殖并诱导其凋亡,但是鲜有关于食管癌细胞的研究。为此本研究将食管癌细胞系SEG-1作为研究对象,将醋酸棉酚和单醛棉酚对食管癌的作用进行对比,以了解其对SEG-1细胞增殖及细胞周期的影响,探讨棉酚在食管癌细胞中的作用机制。随后进一步在食管癌动物模型体内研究棉酚的作用,以探讨棉酚在食管癌治疗中的可行性。第一部分棉酚对人食管癌SEG-1细胞体外增殖抑制作用及其机制研究目的与方法1.本实验采用台盼蓝染色法观察棉酚对食管癌细胞系SEG-1细胞的抗增殖作用。2.本实验采用Wright-Giemsa染色、Hoechst33258荧光显微镜、透射电镜检查棉酚作用的食管癌细胞形态学、琼脂糖凝胶电泳分析棉酚作用食管癌细胞后DNA有无梯状带型、流式细胞检查细胞中DNA含量定量分析细胞凋亡情况等方法来了解棉酚对食管癌细胞系SEG-1细胞的诱导凋亡作用。3.通过测定caspase-9、caspase-3活性及流式细胞仪分析Bcl-2、Bcl-xL在棉酚作用前后的表达变化,探讨棉酚对食管癌细胞系SEG-1细胞的作用机制。4.本实验采用流式细胞仪分析食管癌细胞系SEG-1细胞的细胞周期在棉酚干预前后的变化,探讨棉酚对SEG-1细胞细胞周期的影响。结果醋酸棉酚、单醛棉酚不同浓度对SEG-1细胞生长均存在不同程度的抑制作用,且与药物浓度及作用时间密切相关。1μM醋酸棉酚对SEG-1细胞生长抑制作用较弱。醋酸棉酚、单醛棉酚浓度达到10μM时,SEG-1细胞生长被完全抑制,在培养72 h时,细胞呈负生长状态。当浓度低于10μM时,相同浓度下,单醛棉酚对SEG-1细胞生长抑制作用明显强于醋酸棉酚(P0.05)；当浓度高于10μM时,相同浓度下,单醛棉酚对SEG-1细胞生长抑制作用弱于醋酸棉酚(P0.05)。单醛棉酚在SEG-1细胞培养24h、48h、72h时的IC50值均低于醋酸棉酚(P0.05)。Wright-Giemsa染色普通光镜观察到SEG-1细胞经0.1%DMSO处理后细胞,呈多变形,边缘清晰,形态和状态良好,细胞间排列紧密,规整有序,贴壁生长,有个别凋亡细胞。随着棉酚剂量的增加,细胞形态改变明显,细胞间隙逐渐增大,细胞数逐渐减少；胞体回缩变圆,胞浆内空泡、漂浮样改变细胞增多。Hoechst33258荧光显微镜可见正常细胞核呈弥散均匀的微弱蓝色荧光。而经单醛棉酚处理12h,细胞核或细胞质内有浓染致密的颗粒状强蓝色荧光,细胞质中并有凋亡小体散在分布。透射电镜观察到正常细胞线粒体较多,形态正常,核染色质呈絮点状,均匀分散；经25μM单醛棉酚处理12h后,多数线粒体肿胀变圆,嵴结构消失,内部结构紊乱,细胞核染色质凝集、部分成块；经25μM单醛棉酚处理24 h后,大部分线粒体呈空泡状,嵴结构、内部结构均消失,细胞核变形,块状染色质向核膜靠拢。琼浆电泳分析可观察到：DMSO处理组未出现DNA梯状带,DNA集中在加样孔附近,未出现弥散,是基因组DNA的表现。而经棉酚处理后出现梯状条带,说明棉酚能导致食管癌细胞DNA的片段化,能诱导食管癌细胞凋亡。细胞内DNA含量测定：在5μM、10μM、25μM醋酸棉酚和单醛棉酚处理24 h、48h时测定二倍体细胞比例,结果显示醋酸棉酚和单醛棉酚,随着浓度的增加,细胞的凋亡率逐渐升高(P0.05),而单醛棉酚在相同浓度相同处理时间情况下的细胞凋亡率明显高于醋酸棉酚(P0.05)。细胞凋亡的酶学分析：两种棉酚均可引起SEG-1细胞内caspase-9、caspase-3活性升高,在处理后6h内活性升高显著,随后逐渐降低。醋酸棉酚处理后6hcaspase-9活性显著高于单醛棉酚,而在处理后18h、24h明显低于单醛棉酚,说明醋酸棉酚在处理后早期caspase-9活性升高快,但6h后降得也快,而单醛棉酚处理6h后caspase-9活性下降较慢；caspase-3活性在处理后12h内活性升高显著,随后逐渐降低。醋酸棉酚处理后6h、12h时caspase-3活性显著高于单醛棉酚,而在处理后18 h、24 h明显低于单醛棉酚。Bcl-2家族蛋白分析：醋酸棉酚和单醛棉酚处理后Bc1-2、Bcl-xL表达水平明显降低,以DMSO处理的Bcl-2、Bcl-xL表达量设定为100%,醋酸棉酚处理组Bcl-2表达量下降69.4%,单醛棉酚处理组Bcl-2表达量下降70.8%；醋酸棉酚处理组Bcl-xL表达量下降54.0%,单醛棉酚处理组Bcl-xL表达量下降39.5%。细胞周期分析：应用不同浓度的醋酸棉酚或单醛棉酚处理SEG-1细胞24h后,细胞周期变化较小,但当处理时间延长至48h后,SEG-1细胞有不同程度的G1期细胞增多,S期细胞减少,对G2期影响较小,提示醋酸棉酚能使食管癌细胞停滞在G1期,细胞进入增殖期减少,DNA合成速度减慢。醋酸棉酚25μM处理48h后因亚二倍体或碎片细胞增多,影响周期分析,因此未对该浓度处理的细胞进行分析。而单醛棉酚则使食管癌细胞G2期细胞的增多,G1期细胞减少,S期细胞无明显影响,提示单醛棉酚主要使食管癌细胞停滞在G2期,抑制其增殖。单醛棉酚25μM处理48h的细胞周期分布与DMSO对照组比较无明显差异结论1.棉酚可有效抑制食管癌细胞系SEG-1细胞的增殖,且存剂量-时间效应。而单醛棉酚的作用强于醋酸棉酚。2.棉酚可诱导食管癌细胞系SEG-1细胞的凋亡,且存剂量-时间效应,单醛棉酚的诱导凋亡作用强于醋酸棉酚。这种作用可能与caspase-9、caspase-3的激活及Bcl-2、 Bcl-xL表达降低相关。3.棉酚对食管癌细胞系SEG-1细胞的细胞周期产生调节作用,醋酸棉酚、单醛棉酚可分别使细胞阻滞在G1期、G2期。第二部分棉酚对食管癌细胞系SEG-1细胞裸鼠模型体内作用的研究目的与方法探讨棉酚在食管癌细胞系SEG-1细胞裸鼠模型体内的作用。取健康SPF级BALb/c雌性裸鼠30只,分为6组,即醋酸棉酚40mg/kg组、醋酸棉酚60mg/kg组、单醛棉酚40mg/kg组和单醛棉酚60mg/kg组、空白对照组、阴性对照组,每组5只,空白组未接种及棉酚处理,其余5组均接种SEG-1细胞,醋酸棉酚40mg/kg组、醋酸棉酚60mg/kg组、单醛棉酚40mg/kg组和单醛棉酚60mg/kg组分别在接种肿瘤后第3天给予相应剂量棉酚处理,观察各组肿瘤体积和重量的变化,计算肿瘤生长抑制率和肿瘤生长延迟时间,观察裸鼠接种后体重变化,解剖测量肝、脾重量的变化。结果一般情况：裸鼠在接种前生活状态始终正常、食欲旺盛、行动自如。皮下接种SEG-1细胞1×107个细胞后第1天即出现精神萎靡、饮食不振、体毛耸立等症状,继而行动迟缓直至死亡。裸鼠在接种细胞第4天时皮下出现肉眼可见的明显肿块,肿块逐渐增大,裸鼠存活时间为(13.0±1.0)天。死亡后解剖发现肿瘤灶与周围组织粘连,部分裸鼠腹腔有腹水,肝脾肿大。肿块解剖后制作成细胞悬液,染色后于显微镜下观察肿瘤细胞形态结构与SEG-1细胞一致。病理检查：醋酸棉酚40mg/kg组代表给药组肿瘤与阴性对照组裸鼠的肿瘤标本进行病理对照。给药组肿瘤大小及浸润范围均小于阴性对照组,肿瘤分化稍好于阴性对照组,肿瘤血管形成较阴性对照组差。肿瘤生长变化：各给药组裸鼠皮下肿块均出现不同程度的缩小、肿块生长速度减慢。肿瘤生长抑制率：醋酸棉酚40mg/kg组、醋酸棉酚60mg/kg组、单醛棉酚40mg/kg组、单醛棉酚60mg/kg组分别为14.3%、31.2%、33.7%、32.9%(P0.05),醋酸棉酚40mg/kg组肿瘤生长延迟天数比醋酸棉酚60mg/kg组、单醛棉酚40mg/kg组、单醛棉酚60mg/kg组少1天。阴性对照组裸鼠接种SEG-1细胞后13天后体重显著超过未接种SEG-1细胞的裸鼠。醋酸棉酚40mg/kg组、醋酸棉酚60mg/kg组裸鼠经腹腔注射醋酸棉酚后第1天开始出现活动减少,逐渐消瘦,醋酸棉酚60mg/kg组裸鼠体重在用药第5天开始显著低于阴性对照组,醋酸棉酚40mg/kg组裸鼠体重在用药第6天开始显著低于阴性对照组。单醛棉酚40mg/kg组、单醛棉酚60mg/kg组裸鼠经腹腔注射醋酸棉酚后体重变化与阴性对照组基本一致。棉酚对裸鼠肝、脾重量及生存期的影响：在接种肿瘤后第10天、死亡时解剖裸鼠发现,未接受棉酚干预的阴性对照组裸鼠肝脏较正常裸鼠肝脏明显增重,说明SEG-1肿瘤细胞已经发生肝转移；给予40mg/kg醋酸棉酚干预的接种裸鼠肝脏重量明显低于阴性对照组,而给予40mg/kg或60mg/kg甲醛棉酚干预的裸鼠肝脏较对照组并没有减轻。醋酸棉酚40mg/kg组、醋酸棉酚60mg/kg组裸鼠生存时间明显短于阴性对照组。醋酸棉酚虽有良好的抗肿瘤作用,但同时也使裸鼠生存时间缩短,说明醋酸棉酚毒性作用比单醛棉酚大。而单醛棉酚在确保较强的抗肿瘤作用的同时,无明显的毒副作用,可延长裸鼠的生存期。结论1.醋酸棉酚、单醛棉酚均能抑制食管癌细胞系SEG-1裸鼠模型体内肿瘤的生长。2.单醛棉酚对裸鼠模型的毒性作用比醋酸棉酚小。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1

【参考文献】