膜联蛋白A11对人胃癌细胞株AGS顺铂耐药性影响及其机制的研究

发布时间：2018-11-23 17:18

【摘要】：目的:胃癌是消化系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率一直居高不下,在我国,胃癌死亡率占我国恶性肿瘤死亡率的第2位。由于早期胃癌很少有明显的症状,因此大部分患者确诊时已经是胃癌晚期,失去手术机会,化疗成为胃癌主要治疗手段之一。顺铂是各期胃癌化疗的一线药物,但是有效率仍然不超过20%,其中胃癌对顺铂耐药是胃癌化疗失败的重要原因。随着胃癌顺铂耐药机制的研究深入,一系列耐药相关基因相继被发现,其中膜联蛋白A(Annexins A,ANXA)家族在人胃癌细胞耐药中发挥着重要作用。但是膜联蛋白A11(Annexin A11,ANXA11)是否与人胃癌细胞AGS顺铂耐药性相关,目前尚未见到相关报道。因此,本研究以人胃癌细胞AGS为研究对象,应用siRNA干扰技术,通过抑制ANXA11基因表达后,检测各组人胃癌细胞AGS对顺铂敏感性,发现转染组较阴性对照组及空白对照组敏感性显著提高,并对其相关机制进行初步探讨,为缓解胃癌细胞对顺铂耐药性提供了一定的实验依据。方法:培养人胃癌细胞株AGS和人胃癌细胞株MGC-803,应用实时荧光定量多聚酶链式反应(Quantitative real-time reverse transcription,qPCR)、Western blot检测两株细胞ANXA11 mRNA及蛋白水平的表达。设计并且合成针对ANXA11基因的特异性干扰序列siRNA及其阴性对照序列,ANXA11 siRNA及阴性对照序列按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书,瞬时转入人胃癌细胞AGS,转染24、48、72小时后分别以qPCR、Western blot分别检测ANXA11 mRNA及蛋白水平的表达情况,检测抑制效果。实验分组为:转染组(转染ANXA11-siRNA-2的人胃癌细胞AGS)、阴性对照组(转染ANXA11-siRNA-NC的人胃癌细胞AGS)、空白对照组(人胃癌细胞AGS),以ANXA11-siRNA转染人胃癌细胞AGS 24、48、72小时后,用CCK-8法检测各组细胞在不同浓度顺铂下的细胞抑制率并计算各组细胞IC50及IC20(考虑IC50顺铂对人胃癌细胞AGS杀伤较大,后续试验采用IC20顺铂处理细胞)。实验分组为:联合组(转染ANXA11-siRNA-2的人胃癌细胞AGS并以其IC20顺铂处理)、阴性对照组(转染ANXA11-siRNA-NC的人胃癌细胞AGS)、空白对照组(人胃癌细胞AGS),应用流式细胞术对各实验组人胃癌细胞AGS的凋亡率进行检测。转染48小时,分别提取各组人胃癌细胞AGS总mRNA、蛋白,分别应用qPCR、Western blot检测各组人胃癌细胞AGS中Bax和Bcl-2mRNA及蛋白水平表达的改变。结果:1 ANXA11 mRNA在人胃癌细胞AGS中的相对表达量为:0.086±0.022,ANXA11 mRNA在人胃癌细胞MGS-803中的相对表达量为:0.223±0.008。ANXA11蛋白在人胃癌细胞AGS中的相对表达量为:1.969±0.105,ANXA11蛋白在人胃癌细胞MGS-803中的相对表达量为:0.935±0.078。人胃癌细胞AGS与人胃癌细胞MGC-803相比,ANXA11 mRNA及蛋白表达均显著升高(P0.01)。2 ANXA11-siRNA筛选2.1以ANXA11-siRNA-1,ANXA11-siRNA-2,ANXA11-siRNA-3,ANXA11-siRNA-123转染人胃癌细胞AGS 24、48、72小时后,通过qPCR检测ANXA11 mRNA表达情况。结果显示,与空白对照组及阴性对照组相比,各组ANXA11-siRNA对ANXA11 mRNA的表达量均有不同程度的抑制作用(F=20.891,P=0.000),其中ANXA11 siRNA转染48小时最好,以ANXA11-siRNA-2的抑制效率最高,为82.36%。2.2分别以80nM、100 n M、120n M、150 n M ANXA11-siRNA-2转染胃癌AGS细胞24、48、72小时后,以Western blot检测ANXA11蛋白表达情况。结果发现,与阴性对照组及空白对照组相比,各组对ANXA11蛋白表达均具有一定抑制作用(F=51.641,P=0.000),其中ANXA11-siRNA-2转染48小时最好,以100n M ANXA11-siRNA-2抑制效率最高,达到57.03%。3 ANXA11-siRNA-2转染人胃癌细胞AGS 48小时后,对顺铂的IC50分别为:转染组为:1.923±0.205μg/ml,阴性对照组为:3.817±0.413μg/ml,空白对照组为4.280±0.216μg/ml;对顺铂的IC20分别为:转染组为:0.105±0.012μg/ml,阴性对照组为:0.289±0.154μg/ml,空白对照组为0.233±0.329μg/ml。转染ANXA11 siRNA后人胃癌细胞AGS对顺铂的敏感性显著高于空白对照组及阴性对照组(F=149.000,P=0.000)。4转染组凋亡率为(16.557±0.979)%,联合组凋亡率为(40.416±1.652)%,阴性对照组为(6.560±0.680)%,空白对照组为(5.387±0.620)%。与空白对照组及阴性对照组相比,联合组和转染组凋亡率均显著提高(F=698.733,P=0.000);联合组较转染组凋亡率显著提高(P=0.000)。5 ANXA11-siRNA-2转染对Bax、Bcl-2基因表达的影响qPCR检测ANXA11-siRNA-2抑制ANXA11表达后,Bax、Bcl-2mRNA表达的改变。结果显示,将100n M的ANXA11-siRNA-2转染人胃癌细胞AGS 48小时,与空白对照组及阴性对照组相比,联合组及转染组Bcl-2 mRNA表达显著降低(F=41.046,P=0.000),Bax mRNA表达显著升高(F=34.205,P=0.000);联合组较转染组Bcl-2 mRNA表达显著降低(P=0.003),Bax mRNA表达显著升高(P=0.014)。Western blot检测ANXA11-siRNA-2抑制ANXA11表达后,Bax、Bcl-2蛋白表达的改变。结果显示,将100n M的ANXA11-siRNA-2转染人胃癌细胞AGS 48小时,与阴性对照组及空白对照组相比,联合组及转染组Bcl-2蛋白表达显著降低(F=30.184,P=0.000),Bax蛋白表达显著升高(F=41.424,P=0.000);联合组较转染组Bcl-2蛋白表达显著降低(P=0.002),Bax mRNA表达显著升高(P=0.049)。结论:1与人胃癌细胞株MGC-803相比,人胃癌细胞株AGS中ANXA11mRNA及蛋白表达较高,通过抑制ANXA11基因表达可提高人胃癌细胞AGS凋亡率。2通过抑制ANXA11基因表达,可增强顺铂对人胃癌细胞AGS抑制作用,从而提高人胃癌细胞AGS对顺铂敏感性。ANXA11可能是参与人胃癌细胞AGS顺铂耐药新的基因。3 ANXA11可能通过上调抑凋亡基因Bcl-2、下调促凋亡基因Bax的表达,从而参与人胃癌细胞株AGS对顺铂耐药。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

【参考文献】